潘伯臣，馮翼飛，葉瑩心

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科輔助生殖中心，沈陽 1 1 0 0 0 4）

卵泡發(fā)育是一個以形態(tài)變化為特征的生長過程，同時伴隨著卵泡功能的分化。這種發(fā)育與分化過程是在垂體分泌的促性腺激素、性激素以及卵巢的局部細(xì)胞因子的協(xié)同作用下完成的。其中，卵巢局部因子如生長因子的作用是不可或缺的，因此也成為近年來卵巢生殖生理研究的熱點(diǎn)問題。肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子（heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF）是表皮生長因子家族中新的成員，因與肝素有很強(qiáng)的結(jié)合力而得名。HB-EGF有2種存在形式：溶解型HBEGF（soluble HB-EGF，sHB-EGF）和膜結(jié)合型HBEGF（proHB-EGF），后者是溶解型（也稱為分泌型）的前體。sHB-EGF是多種細(xì)胞的分裂原，而proHBEGF的生物學(xué)效應(yīng)則主要表現(xiàn)為抑制細(xì)胞生長等［1］。

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，不孕女性患者在接受體外受精—胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）的超促排卵過程中，獲得的黃素化顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下表達(dá)HB-EGF及其特異受體，提示了HB-EGF可能在卵泡發(fā)育及分化中發(fā)揮一定的作用［2，3］。但是，在體情況下卵泡中是否存在HB-EGF表達(dá)，尚未見報道。本研究檢測IVF-ET超促排卵過程中生成的黃素化卵泡中HB-EGF的表達(dá)，并探討sHB-EGF和proHB-EGF與卵泡發(fā)育的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑：HB-EGF抗體（美國Santa Cruz公司），高速冷凍離心機(jī)（3C15K，美國Sigma公司），多功能電泳儀（北京六一儀器廠），722可見光分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），凝膠自動成像及分析系統(tǒng)（ChemiImager 5500，美國Alpha公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料：選擇在我院輔助生殖中心接受IVF-ET治療的患者42例，年齡25~37歲。取卵時，在同一患者同時獲取大卵泡與小卵泡的卵泡液。其中17例患者同時分離、獲取了黃素化顆粒細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析。

1.2 方法

1.2.1 超促排卵：取卵前常規(guī)給予患者刺激卵泡發(fā)育治療，包括使用促性腺激素釋放激素激動劑（達(dá)菲林或抑那通）降調(diào)垂體敏感性和使用人絕經(jīng)期促性腺激素（麗申寶或果納芬）刺激卵泡發(fā)育。當(dāng)最大卵泡長至大于18 mm時，給予人體絨膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）5 000~10 000 IU促進(jìn)卵泡進(jìn)成熟。hCG注射后36 h取卵。

1.2.2 卵泡液及顆粒細(xì)胞的采集：按我院常規(guī)經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下取卵，記錄卵泡直徑大小，直徑>16 mm定義為大卵泡（成熟卵泡），卵泡直徑<14 mm定義為小卵泡（未成熟卵泡）。取卵日根據(jù)需要每側(cè)卵巢各取第1個卵泡（大或小卵泡）。卵泡液以1 500 r/min離心10 min，取上清-20℃冰箱保存待測。然后將細(xì)胞沉淀物置于60%細(xì)胞分離液Percoll表層，4℃、1 200 r/min離心15 min以去除紅細(xì)胞，收集中間相細(xì)胞，PBS洗凈后取少許細(xì)胞置于顯微鏡下觀察，確認(rèn)為顆粒細(xì)胞后，將顆粒細(xì)胞置于-20℃冰箱保存待測。

1.2.3 Western blot測定卵泡液中sHB-EGF蛋白：卵泡液中蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法，按試劑盒說明操作。蛋白變性處理后經(jīng)12%SDS-PAGE電泳2 h，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用含5%去脂奶粉的TTBS封閉4℃過夜，加一抗（1∶400）室溫下孵育2 h，加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫下孵育2 h，清洗后酶法顯色。結(jié)果量化分析使用FlourChem V 2.0凝膠成像分析軟件（美國Alpha公司），記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進(jìn)行定量分析。

1.2.4 Western blot測定顆粒細(xì)胞中proHB-EGF蛋白：（1）蛋白的提?。喝〕鲆旱袃龃娴臉?biāo)本，加入RIPA裂解液作用30 min，經(jīng)超聲粉碎后，10 000 r/min離心30 min，吸取上清備用。（2）其余步驟同卵泡液中sHB-EGF蛋白的測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)，計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

42例患者穿刺的42個大卵泡中有2個（4.76%）為空卵泡，42個小卵泡中有9個（21.43%）空卵泡，大小卵泡比較，空卵泡比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

42例患者中，有17例患者可以同時分離到大、小卵泡的卵泡液和顆粒細(xì)胞；這部分患者的材料用于HB-EGF的檢測和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大卵泡與小卵泡的卵泡液中sHB-EGF蛋白全部呈陽性表達(dá)；同樣，所有顆粒細(xì)胞中均檢測到proHB-EGF的蛋白表達(dá)，見圖1。

大卵泡和小卵泡卵泡液中sHB-EGF蛋白表達(dá)量分別為288.37±15.44和172.06±22.28，大卵泡和小卵泡顆粒細(xì)胞中proHB-EGF蛋白表達(dá)量分別為76.32±10.05和 28.50±6.20。同一卵泡中，卵泡液中sHB-EGF含量明顯大于顆粒細(xì)胞中proHB-EGF表達(dá)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。大、小卵泡比較，大卵泡液中sHB-EGF含量明顯大于小卵泡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；同樣，大卵泡中顆粒細(xì)胞的proHB-EGF表達(dá)量明顯高于小卵泡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；但小卵泡中sHB-EGF平均含量與proHB-EGF平均含量的比值（6.04）明顯高于大卵泡（3.78）。此外，2個大的空卵泡中sHB-EGF含量分別為76.78和89.86。

3 討論

原始卵泡一旦啟動生長，便是一個連續(xù)不斷的發(fā)育和分化過程，要么變成優(yōu)勢卵泡，成熟與排放，要么中途細(xì)胞凋亡形成閉鎖卵泡。通常以為卵泡是由垂體促卵泡生長激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）調(diào)控的，因?yàn)槁雅蓊w粒細(xì)胞中存在FSH受體，而且臨床上也發(fā)現(xiàn)女性基礎(chǔ)FSH水平與卵巢儲備功能有關(guān)［4］，但許多生長因子參與了卵泡的發(fā)育及分化過程。例如，轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）可以促進(jìn)FSH受體的表達(dá)，放大FSH誘導(dǎo)的芳香化酶活化、黃體酮生成及黃體生成素（luteinizing hormone，LH）受體產(chǎn)生的生理過程［5］。IVF-ET超促排卵過程中，通常使用超生理劑量的FSH促使卵泡產(chǎn)生大量卵泡，繼而使用hCG（LH）進(jìn)一步促使生長的卵泡成熟與分化，以便獲取更多的成熟卵子用于體外受精和胚胎移植，提高接受IVF-ET治療患者的妊娠率。有報道指出，卵巢局部因子特別是生長因子同樣也介導(dǎo)了FSH/LH（hCG）對卵泡的刺激作用。例如，血管內(nèi)皮生長因子被認(rèn)為是IVF-ET過程中產(chǎn)生卵巢過度刺激綜合征的主要介導(dǎo)因子［6］。但I(xiàn)VF-ET超促排卵過程中產(chǎn)生的卵泡中是否存在HB-EGF，以及HB-EGF是否參與了卵泡的發(fā)育與分化，至今尚未見報道。此外，HB-EGF蛋白的2種存在形式即sHB-EGF和pro－HB-EGF，它們在卵泡中的分布如何以及它們與卵泡發(fā)育和分化的關(guān)系也不十分清楚。

我們在先前的動物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠卵巢中HB-EGFmRNA表達(dá)量在大鼠發(fā)情前期的上午（相當(dāng)于卵泡生長期）明顯高于發(fā)情前期的晚上（此時卵巢中存在大量排卵前的成熟卵泡）；與此同時，大多數(shù)的初級卵泡和全部次級卵泡的顆粒細(xì)胞中存在proHB-EGF的蛋白表達(dá)，但成熟卵泡的顆粒細(xì)胞中卻不存在proHB-EGF的表達(dá)；而且，閉鎖卵泡中正在凋亡的顆粒細(xì)胞也表達(dá)proHB-EGF。類似的現(xiàn)象同樣存在于未成年大鼠假孕模型中：經(jīng)PMSG刺激卵泡生長后，小卵泡及閉鎖卵泡中存在proHB-EGF蛋白表達(dá)，而大卵泡中則不存在［7］。這種現(xiàn)象提示，在卵泡發(fā)育的相對早期階段，HB-EGF的表達(dá)可能主要是為了卵泡的生長發(fā)育，而到卵泡發(fā)育晚期接近成熟階段，HB-EGF新的合成及分泌需要關(guān)閉，以利于卵泡的分化成熟。為了進(jìn)一步研究HB-EGF與人卵泡發(fā)育與分化的關(guān)系，特別是了解HB-EGF是否參與了IVF-ET中FSH/LH促超排卵過程，我們在先前的研究中對體外培養(yǎng)的人黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞中存在HB-EGF及其特異受體的表達(dá)［2，3］。本研究在這些前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討HB-EGF是否存在于在體的卵泡中，以及HB-EGF與IVF-ET超促排卵中卵泡的發(fā)育與分化是否有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有檢測的卵泡中均存在HBEGF的表達(dá)。而且，大卵泡中無論是卵泡液中的sHB-EGF還是顆粒細(xì)胞的proHB-EGF，其含量均明顯高于小卵泡，提示HB-EGF參與了卵泡發(fā)育和成熟的過程。進(jìn)而卵泡中HB-EGF的2種存在形式以sHB-EGF為主，提示在卵泡的發(fā)育及分化過程中sHB-EGF發(fā)揮了主要作用。本研究的另一個重要發(fā)現(xiàn)是，小卵泡中sHB-EGF與proHB-EGF的比值明顯高于大卵泡。小卵泡與大卵泡的不同之處在于小卵泡處于卵泡發(fā)育的相對早期階段，主要生理現(xiàn)象是細(xì)胞增殖、卵泡生長，而大卵泡則處于卵泡發(fā)育的較晚階段，主要是細(xì)胞的分化與成熟，為卵子的成熟與排出構(gòu)建適宜的環(huán)境。因此，相對于大卵泡而言，小卵泡可能更需要生長因子來維系細(xì)胞的增殖和卵泡的生長。從目前HB-EGF相關(guān)的研究結(jié)果看，sHB-EGF對絕大多數(shù)的細(xì)胞具有促增殖作用，而proHB-EGF的作用多為介導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、抑制細(xì)胞生長等［1，8，9］。因此，本研究中小卵泡 sHB-EGF與proHB-EGF比值高于大卵泡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從一個側(cè)面反映了小卵泡比大卵泡更具有生長潛能的現(xiàn)象，與上述的動物實(shí)驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象一致。而且，從卵泡中卵子的回收情況看，大卵泡的卵子回收率明顯高于小卵泡；同時，2個大的空卵泡中sHB-EGF濃度遠(yuǎn)低于含有卵子的大卵泡中sHB-EGF濃度。這一結(jié)果似乎也提示了sHB-EGF對卵子發(fā)育的重要性，但仍需加大樣本量進(jìn)一步探討。

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