張純萍，寧宜寶，宋 立，陳惠娟，習(xí) 碩，袁 欣

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州 225009;3.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206)

沙門(mén)氏菌是一種重要的人畜共患病原微生物，它不僅能夠引起雞的各種疾病，而且感染雞耐過(guò)后經(jīng)常成為隱性帶菌者，不定期排毒，從而感染其他雞只并污染周?chē)h(huán)境，對(duì)肉雞的養(yǎng)殖造成很大危害。更為重要的是，肉雞所攜帶的沙門(mén)氏菌也是一種重要的食源性病原菌。研究［1-2］表明，人感染腸炎沙門(mén)氏菌主要是由于食用了被污染的禽蛋和禽肉所引起。

沙門(mén)氏菌血清型眾多，目前已經(jīng)鑒定出2500多種血清型。不同國(guó)家、不同地區(qū)雞群中的優(yōu)勢(shì)血清型不同，不同血清型的沙門(mén)氏菌對(duì)雞和人的致病性也不相同。全球食源性監(jiān)測(cè)網(wǎng)的檢測(cè)結(jié)果表明［3］，引起公共衛(wèi)生安全的沙門(mén)氏菌主要以腸炎和鼠傷寒兩種血清型為主。肉雞作為人腸炎沙門(mén)氏菌感染的主要來(lái)源，美國(guó)和歐盟等西方發(fā)達(dá)國(guó)家早在20世紀(jì)90年代就已經(jīng)開(kāi)展了對(duì)食品動(dòng)物中沙門(mén)氏菌病流行性的調(diào)查，而且每年都會(huì)發(fā)布監(jiān)測(cè)結(jié)果報(bào)告;歐盟還制定了肉雞腸炎沙門(mén)氏菌的嚴(yán)格控制措施和控制目標(biāo)［4-5］，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)肉雞中沙門(mén)氏菌流行狀況的研究和調(diào)查資料很少。鑒于此，本研究從2010年4月至2011年10月期間共采集北京地區(qū)28個(gè)肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的健康肉雞盲腸或泄殖腔拭子樣品1310份，分離其中的沙門(mén)氏菌并進(jìn)行血清型鑒定，以了解北京地區(qū)健康肉雞沙門(mén)氏菌的攜帶情況，從而為北京地區(qū)肉雞場(chǎng)沙門(mén)氏菌病的防控和首都的公共衛(wèi)生安全提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 待宰肉雞泄殖腔拭子或屠宰場(chǎng)肉雞的盲腸樣品共1310份，分別采自北京市順義、海淀、懷柔、延慶、平谷等區(qū)縣28個(gè)肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的健康肉雞(41～49日齡)，其中每個(gè)肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)采樣40～50份。樣品采集后4 h內(nèi)分離沙門(mén)氏菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 亞硝酸鹽胱氨酸(SC)、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基和XLT4培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;四硫磺酸鈉煌綠(TTB)購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.3 沙門(mén)氏菌診斷血清(全套193支) 購(gòu)于泰國(guó)S＆A公司。

1.1.4 分子試劑 PCR buffer、dNTP和 GoTaq DNA聚合酶均由普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司提供;DL2000 DNA Marker購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.5 引物合成與測(cè)序 分別由英俊生物技術(shù)有限公司北京合成部和北京測(cè)序部完成。

1.2 方法

1.2.1 沙門(mén)氏菌的分離與鑒定 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的方法［6］進(jìn)行沙門(mén)氏菌的分離，具體為：將泄殖腔拭子或者盲腸樣品用SC和TTB增菌液進(jìn)行常規(guī)增菌培養(yǎng)，然后分別取1環(huán)增菌液劃線接種于沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基和XLT4培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過(guò)夜，可疑菌落用營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)一步純化。

純化后的菌落用PCR方法［7］進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增目的片段invA基因的長(zhǎng)度為284 bp，上下游引物(5'-3')分別為：gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa和tca tcg cac cgt caa agg aac c，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳后進(jìn)行凝膠成像分析。

1.2.2 沙門(mén)氏菌的血清分型 將沙門(mén)氏菌接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后根據(jù)泰國(guó)血清的操作說(shuō)明和國(guó)標(biāo)中沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)方法［8］分別進(jìn)行菌體(O)抗原和鞭毛(H)抗原的檢測(cè)，以生理鹽水作為陰性對(duì)照，與試驗(yàn)抗血清出現(xiàn)凝集反應(yīng)者即判定為陽(yáng)性。根據(jù)O抗原和H抗原的檢測(cè)結(jié)果，參照沙門(mén)氏菌屬抗原表［9］判定血清型，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 沙門(mén)氏菌的分離鑒定結(jié)果 本研究總共從1310份樣品中分離鑒定出沙門(mén)氏菌54株，總分離率為4.1%。不同養(yǎng)殖場(chǎng)沙門(mén)氏菌的分離情況不同，在所采樣的28個(gè)肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)中，僅從其中的15個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)(53.6%)分離到了沙門(mén)氏菌，而其余13個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)(46.4%)均未分離到沙門(mén)氏菌，這15個(gè)沙門(mén)氏菌陽(yáng)性肉雞場(chǎng)的分離情況見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，15個(gè)沙門(mén)氏菌陽(yáng)性肉雞場(chǎng)中沙門(mén)氏菌的攜帶情況差異很大，攜帶率在2.0% ～16.0%之間。

表1 15個(gè)陽(yáng)性肉雞場(chǎng)沙門(mén)氏菌的分離情況和血清分型結(jié)果

2.2 沙門(mén)氏菌的血清分型 15個(gè)陽(yáng)性肉雞場(chǎng)沙門(mén)氏菌的血清型分布見(jiàn)表1。由表1可知，不同肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)沙門(mén)氏菌的血清型分布不同，但是大多數(shù)肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)中分離的沙門(mén)氏菌均集中于1～2個(gè)血清型。總體來(lái)看，在所分離的54株沙門(mén)氏菌中，腸炎(S.enteritidis)(31.5%)和爪哇安那(S.javiana)(25.9%)為兩種優(yōu)勢(shì)血清型，其次是禽傷寒(S.gallinarum)(9.3%)和馬流產(chǎn)(S.abortusequi)(5.6%)沙門(mén)氏菌。本研究尚分離到6株II型(薩拉姆亞種，即S.enterica subsp.salamae)和5株不可分型的沙門(mén)氏菌。

3 討論

3.1 健康肉雞沙門(mén)氏菌的攜帶情況 根據(jù)北京地區(qū)肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的分布情況，本研究共調(diào)查了該地區(qū)具有代表性的28個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)健康肉雞體內(nèi)沙門(mén)氏菌的流行情況，并從其中15個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中分離到了沙門(mén)氏菌?？傮w來(lái)看，本研究中健康肉雞沙門(mén)氏菌的平均攜帶率為4.1%，陽(yáng)性肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的平均分離率為7.4%，這與其他國(guó)家的研究結(jié)果相似。歐盟27個(gè)成員國(guó)在2009年和2010年對(duì)肉雞進(jìn)行的沙門(mén)氏菌監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，其平均帶菌率分別為5.0%和4.1%［10］;越南對(duì)302份肉雞糞便樣品進(jìn)行沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌的攜帶率為7.9%［11］。

本研究中不同養(yǎng)殖場(chǎng)的分離率之間存在較大偏差，這說(shuō)明健康成雞體內(nèi)沙門(mén)氏菌的攜帶情況與養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)管理密切相關(guān)［1］。由于禽傷寒、腸炎等血清型的沙門(mén)氏菌可通過(guò)種雞垂直傳播，因此該分離結(jié)果也可能與種雞的沙門(mén)氏菌攜帶以及種蛋的污染情況直接相關(guān)。歐盟的研究結(jié)果表明，2009年和2010年平均分別有2.4%和1.6%的父母代肉種雞感染了沙門(mén)氏菌［10］，在我國(guó)雖然沒(méi)有具體的感染率調(diào)查報(bào)道，但是種雞與種蛋的沙門(mén)氏菌污染水平也不容忽視。

3.2 沙門(mén)氏菌的血清型分布 從種屬關(guān)系來(lái)分，沙門(mén)氏菌可以分為邦戈?duì)柡湍c道兩個(gè)種，腸道沙門(mén)氏菌又分為以下6個(gè)亞種：腸道亞種、薩拉姆亞種、亞利桑那亞種、雙相亞利桑那亞種、浩敦亞種和因迪卡亞種。根據(jù)沙門(mén)氏菌菌體(O)抗原、莢膜(Vi)抗原和鞭毛(H)抗原的不同，又可將沙門(mén)氏菌分為許多血清型。2007年的WHO抗原表［9］中已經(jīng)包含2579種血清型，其中絕大多數(shù)為腸道沙門(mén)氏菌(僅有22種屬于邦戈?duì)柹抽T(mén)氏菌)。在2557種腸道沙門(mén)氏菌中，僅腸道亞種具有具體的血清型名稱(1531個(gè)血清型)，其余5個(gè)亞種的血清型均以亞種名稱表示。在本研究中，除了11株沙門(mén)氏菌(5株不可分型和6株II型)外，其余從健康肉雞體內(nèi)分離的沙門(mén)氏菌均屬于腸道亞種。

本研究中不同養(yǎng)殖場(chǎng)沙門(mén)氏菌的血清型分布不同，但是整體來(lái)看，最常見(jiàn)的為腸炎沙門(mén)氏菌，這與大多數(shù)國(guó)家所分離到的優(yōu)勢(shì)血清型基本一致。美國(guó)2010年從肉雞中分離的沙門(mén)氏菌主要以腸炎和肯塔基血清型為主［12］;而歐盟2010年分離的主要血清型為腸炎和鴨沙門(mén)氏菌［10］。本研究中位居第2的血清型為爪哇安那，占比25.9%，這與越南2001年的沙門(mén)氏菌血清型檢測(cè)結(jié)果［11］類(lèi)似，但是在美國(guó)和歐盟流行性位居前10的沙門(mén)氏菌血清型中均未發(fā)現(xiàn)該血清型，因此爪哇安那沙門(mén)氏菌的攜帶可能具有地區(qū)性的特點(diǎn)。

研究表明，在大多數(shù)國(guó)家，90%以上的沙門(mén)氏菌都屬于30種左右的血清型［3］，但是近年來(lái)有些很少見(jiàn)的血清型又有增加的趨勢(shì)［13］。在本研究中，除II型和不可分型的沙門(mén)氏菌外，共分離到8個(gè)血清型的沙門(mén)氏菌;并且大多數(shù)肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)中分離的沙門(mén)氏菌均集中于1～2個(gè)血清型，這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)長(zhǎng)期持續(xù)存在該血清型的感染或者種雞來(lái)源相關(guān)。由于不同地區(qū)沙門(mén)氏菌的血清型分布差異很大，因此非常有必要對(duì)全國(guó)不同地區(qū)肉雞沙門(mén)氏菌的血清型分布進(jìn)行系統(tǒng)詳細(xì)的監(jiān)測(cè)，以了解全國(guó)肉雞沙門(mén)氏菌的攜帶情況。

本研究調(diào)查了北京地區(qū)健康肉雞體內(nèi)沙門(mén)氏菌的攜帶情況，為開(kāi)展全國(guó)性的沙門(mén)氏菌流行病學(xué)調(diào)查研究打下了良好的基礎(chǔ)，并為北京地區(qū)肉雞場(chǎng)沙門(mén)氏菌病的防控和公共衛(wèi)生安全提供了資料和技術(shù)支持。

［1］Snow L C，Davies R H，Christiansen K H，et al.Investigation of risk factors for Salmonella on commercial egg-laying farms in Great Britain 2004-2005［J］.Vet Rec，2010，166(19)：579-586.

［2］Kimura A C，Reddy V，Marcus R，et al.Chicken consumption is a newly identified risk factor for sporadic Salmonella enterica serotype Enteritidis infections in the United States：A case-control study in FoodNet sites［J］.Clin Infect Dis，2004，38(Suppl 3)：S244-252.

［3］WHO Global Salm-Surv Progress Report，2000 ～ 2005［R］.WHO Press，World Health Organization，20 Avenue Appia，1211 Geneva 27，Switzerland.2006：24-25.

［4］Regulation(EC)No 2160/2003 of the European Parliament and of the Council of 17 November 2003 on the control of Salmonella and other specified food-borne zoonotic agents［J］.Official Journal of the European Union，2003，12：1-15.

［5］Commission regulation(EC)No 646/2007 of 12 June 2007 implementing Regulation(EC)No 2160/2003 of the European Parliament and of the Council as regards a Community target for the reduction of the prevalence of Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium in broilers and repealing Regulation(EC)No 1091/2005［J］.Official Journal of the European Union，2007，6：21-25.

［6］陳惠娟，張純萍，李金貴.不同增菌液和培養(yǎng)基對(duì)沙門(mén)氏菌分離效果的比較研究［J］.中國(guó)家禽，2011，(24)：20-23.

［7］Rahn K，De Grandis S A，Clarke R C，et al.Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella［J］.Molecular and Cellular Probes，1992，6(4)：271-279.

［8］GB 4789.4-2010，食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)［S］.

［9］Antigenic Formulae of the Salmonella Serovars［M］.9th edition，2007，WHO Collaborating Center for Reference and Research on Salmonella Patrick A.D.Grimont，F(xiàn)rancois-Xavier Weill，Institut Pasteur，28 rue du Dr.Roux，75724 Paris Cedex 15，F(xiàn)rance.

［10］ Eurosurveillance editorial team.The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses，Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2010［J］.EuroSurveill，2012，17(10)：71-94.

［11］ Tran T P，Ly T L，Nguyen T T，et al.Prevalence of Salmonella spp.in pigs，chickens and ducks in the Mekong Delta，Vietnam［J］.Vet Med Sci，2004，66(8)：1011-1014.

［12］ USDA.National Antimicrobial Resistance Monitoring System-Enteric Bacteria，Animal Arm(NARMS)：2010 NARMS Animal Arm Annual Report［R］.Athens，GA：U.S.Department of Agriculture，Agricultural Research Service，2012：18.

［13］ Shukho Kim.Salmonella Serovars from Foodborne and Waterborne Diseases in Korea，1998-2007：Total Isolates Decreasing Versus Rare Serovars Emerging［J］.J Korean Med Sci，2010，25：1693-1699.