申世剛，宋煒，沙潤(rùn)甲，李揮,，張敬軒

(1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，教育部藥物化學(xué)與分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002；2.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050051)

凝膠滲透色譜-固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定油脂及油炸食品中的酚類(lèi)抗氧化劑

申世剛1，宋煒1，沙潤(rùn)甲1，李揮1,2，張敬軒2

(1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，教育部藥物化學(xué)與分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002；2.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050051)

建立了使用凝膠滲透色譜-固相萃取-高效液相色譜(GPC-SPE-HPLC)測(cè)定油脂及油炸食品中的4種常見(jiàn)酚類(lèi)抗氧化劑沒(méi)食子酸丙酯(PG)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA)和二丁基羥基甲苯(BHT)的方法.試樣經(jīng)乙酸乙酯-環(huán)己烷(V(乙酸乙酯)∶V(環(huán)已烷)=1∶1)和乙腈漩渦振蕩萃取，凝膠滲透色譜(GPC)和HLB固相萃取柱凈化，以乙腈-體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，以BDS HYPERSIL C18柱作為分離柱，在檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm下用紫外檢測(cè)器檢測(cè).方法的檢出限為0.6～1.0 mg/kg(油脂樣品)和0.3～0.5 mg/kg(油炸樣品)，定量限為2～3 mg/kg(油脂樣品)和1～1.7 mg/kg(油炸樣品)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)rgt;0.998，平均回收率為80.3%～94.0%(油脂樣品)和80.3%～93.4%(油炸樣品)；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.22%～8.80%(油脂樣品)和2.74%～9.62%(油炸樣品).該方法選擇性好，靈敏度高，檢出限低，能夠成功地應(yīng)用于油脂及油炸食品中4種常見(jiàn)酚類(lèi)抗氧化劑的檢測(cè).

凝膠滲透色譜；固相萃取柱；高效液相色譜；酚類(lèi)抗氧化劑；油脂及油炸食品

油脂及油炸食品中常需要添加抗氧化劑來(lái)延長(zhǎng)油品氧化反應(yīng)的誘導(dǎo)期，減緩油品氧化速度，以達(dá)到延長(zhǎng)油品的使用壽命.最常添加的抗氧化劑有沒(méi)食子酸丙酯(propyl gallate，PG)、叔丁基對(duì)苯二酚(tertiary butyl-hydroquinone，TBHQ)、叔丁基對(duì)羥基茴香醚(butylated hyd-roxylanisole，BHA)、二丁基羥基甲苯(butylated hyd-roxytoluene，BHT)等酚類(lèi)抗氧化劑，這些抗氧化劑可以單獨(dú)使用，也可以混合使用.由于長(zhǎng)期過(guò)量食用含抗氧化劑的食品,對(duì)人體健康有不利影響.因此很多國(guó)家對(duì)食用抗氧化劑都有嚴(yán)格的使用限量[1]，并且有些抗氧化劑在一些國(guó)家已禁止使用.

目前，常用于油脂及油炸食品中酚類(lèi)抗氧化劑的測(cè)定方法有液相色譜法[2-7]、氣相色譜法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-12]、液相色譜-質(zhì)譜法[13]等.這些方法中，對(duì)樣品的前處理大多采用液-液提取方式，但是其對(duì)脂溶性抗氧化劑的提取效率較低、脂肪基質(zhì)很難凈化完全，選擇性不好、靈敏度不高、準(zhǔn)確度低，當(dāng)樣品成分比較復(fù)雜時(shí)，雜質(zhì)干擾可能?chē)?yán)重影響檢測(cè)結(jié)果，從而無(wú)法滿(mǎn)足含抗氧化劑食品的市場(chǎng)監(jiān)管和進(jìn)出口貿(mào)易要求.實(shí)驗(yàn)采用漩渦振蕩萃取，凝膠滲透色譜(GPC)和HLB固相萃取柱凈化，高效液相色譜(HPLC)測(cè)定油脂及油炸食品中4種酚類(lèi)抗氧化劑.本方法選擇性好，靈敏度高，自動(dòng)化水平高.能準(zhǔn)確、快速地測(cè)定油脂及油炸食品中的4種酚類(lèi)抗氧化劑.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；J2凝膠色譜凈化系統(tǒng)(美國(guó)J2公司)；固相萃取裝置(美國(guó)Agilent公司)；Oasis HLB固相萃取柱(1 g，6 mL，美國(guó)Waters公司)；氮吹儀；KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗器；PG，TBHQ，BHA，BHT標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷為色譜純；其他試劑均為分析純.

精確稱(chēng)取各抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品0.100 g，用甲醇溶解定容至100 mL，制得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.00 mg/mL)，置于冰箱中冷藏保存.使用時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，再用乙腈稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合工作溶液，冷藏保存.

1.2樣品前處理

油脂樣品：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g試樣于GPC管中，加入乙酸乙酯-環(huán)己烷(V(乙酸乙酯)∶V(環(huán)已烷)=1∶1)至10 mL，渦旋振蕩提取2 min，過(guò)GPC凈化，收集7.0～13.5 min的餾分，40 ℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)屑尤胍宜嵋阴?環(huán)己烷至10 mL，渦旋振蕩提取2 min，經(jīng)過(guò)GPC進(jìn)行二次凈化，將餾分在40 ℃下氮?dú)獯蹈?，加體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇-水定容至2 mL，過(guò)HLB固相萃取柱(事先依次用3 mL甲醇，3 mL水活化柱子)并收集濾液，用4 mL甲醇洗脫，收集約6 mL的洗脫液，40 ℃下氮?dú)獯蹈?，加乙腈定容?.0 mL, 渦旋混勻，15 000 r/min離心1 min，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后, 供 HPLC測(cè)定.

油炸食品：稱(chēng)取(2.0±0.05)g 粉碎均勻的樣品于50 mL 離心管中，加入15 mL 乙腈，旋渦振蕩混勻1 min,室溫下超聲提取15 min.取出離心管，15 000 r/min離心3 min, 將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，用5 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并2次上清液于40 ℃下氮?dú)獯蹈?，加入乙酸乙?環(huán)己烷至10 mL，以下步驟同油脂樣品的測(cè)定.

1.3 GPC條件

GPC條件：CO785凝膠凈化柱(美國(guó)J2公司)，填料為Boi Beads S-X3(200～400目)；流動(dòng)相為乙酸乙酯-環(huán)己烷；流量4.7 mL/min；進(jìn)樣量5 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；樣品收集時(shí)間7.0～13.5 min.

1.4液相色譜條件

色譜柱：BDS HYPERSIL C18色譜柱(100 mm×4.6 mm×2.4 μm)；流動(dòng)相：A(體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液)-B(乙腈)；梯度洗脫：0～2 min, 45%B；2～5 min, 45%～70%B；5～6 min, 70%～95%B；6～18 min, 95%～100%B；后運(yùn)行時(shí)間：5 min；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35 ℃.

2 結(jié)果與討論

2.1樣品前處理?xiàng)l件的選擇及優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

分別采用甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯-環(huán)己烷(V(乙酸乙酯)∶V(環(huán)已烷)=1∶1)作為提取溶劑對(duì)同一油炸食品進(jìn)行提取,對(duì)比并考察了不同提取試劑對(duì)4種抗氧化劑的回收率.結(jié)果表明，乙酸乙酯-環(huán)己烷的提取效率最低.乙醇和甲醇的沸點(diǎn)相對(duì)較高濃縮費(fèi)時(shí)，且提取的雜質(zhì)太多,提取效率低，不利于后續(xù)GPC和SPE凈化，影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確性.采用乙腈作為提取溶劑時(shí),雜質(zhì)含量相對(duì)較低，提取效率高，準(zhǔn)確性高，因此選用乙腈作為提取溶劑.比較了不同的萃取時(shí)間(10,15,20 min)，萃取體積(5,10,15,20 mL)和萃取次數(shù)(1,2,3次)對(duì)回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先用15 mL乙腈超聲15 min萃取第1次，后用5 mL乙腈重復(fù)萃取第2次，平均回收率可達(dá)到90%以上.

2.1.2 GPC和SPE凈化條件的選擇

相對(duì)于單一的液-液萃取方式而言，凝膠滲透色譜不但能有效地去除油脂、天然色素等高分子質(zhì)量的干擾物，而且可用于小分子物質(zhì)的分離和鑒定，以及分析化學(xué)性質(zhì)相同分子體積不同的高分子同系物.在流速為4.7 mL/min條件下，向空白油脂基質(zhì)中添加10 mg/kg的抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3條件進(jìn)行凈化，如圖1.為了確定4種抗氧化劑在GPC上的收集時(shí)間，用1 μg/mL的抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述條件進(jìn)行凈化，如圖2.從圖2可知，4種抗氧化劑的流出時(shí)間集中在7.0～11.0 min.考慮到收集的完全性，用5 μg/mL的抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述條件進(jìn)行凈化，分別收集6.5～11.0 min，6.5～11.5 min, 7.0～11.0 min, 7.0～11.5 min, 7.0～12.5 min及7.0～13.5 min的餾分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，收集時(shí)間段為7.0～13.5 min時(shí)4種抗氧化劑的回收率均達(dá)到90%以上.用10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述條件分別進(jìn)行GPC一次凈化和GPC二次凈化，收集7.0～13.5 min的餾分，測(cè)定一次凈化和二次凈化時(shí)的回收率，結(jié)果表明，一次凈化和二次凈化時(shí)4種抗氧化劑的平均回收率分別為87.6%和92.0%.因此，最終確定收集時(shí)間段為7.0～13.5 min，用GPC進(jìn)行二次凈化時(shí)4種目標(biāo)物質(zhì)的回收率最高.

圖1 油脂和抗氧化劑的GPC色譜 圖2 抗氧化劑的GPC色譜

為使目標(biāo)化合物得到進(jìn)一步的分離和富集，比較了在油脂和油炸食品2種空白基質(zhì)中分別添加濃度為50 mg/kg和25 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行固相萃取3次，比較了3種固相萃取柱(硅膠、C18柱和HLB柱)的凈化效果.結(jié)果表明，油脂加標(biāo)的平均回收率分別為82.3%(硅膠)、86.7%(C18柱)和90.3%(HLB柱)，油炸食品加標(biāo)的平均回收率分別為80.5%(硅膠)、84.4%(C18柱)和91.6%(HLB柱).通過(guò)比較不同的洗脫試劑(甲醇、乙腈)、洗脫試劑的體積(3，4，和5 mL)對(duì)回收率的影響，最終確定使用HLB柱凈化，4 mL的甲醇洗脫時(shí)效果最好.

2.2色譜條件的選擇

實(shí)驗(yàn)優(yōu)選梯度洗脫，對(duì)比了不同流動(dòng)相的配比，進(jìn)一步優(yōu)化柱溫、進(jìn)樣量和流速等條件，使4種色譜峰能夠完全分開(kāi)，峰形尖銳，無(wú)峰拖尾現(xiàn)象，相應(yīng)值高，樣品測(cè)定可在18 min內(nèi)完成.見(jiàn)圖3，圖4.

1.PG; 2.TBHQ; 3.BHA ;4.BHT. 1.PG; 2.TBHQ; 3.BHA; 4.BHT.

2.3方法的線(xiàn)性方程和檢出限

取4 種酚類(lèi)抗氧化劑的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈作為稀釋液 ，配制成6種不同質(zhì)量濃度(1,5,10,20,50,100 μg/mL)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照2.5色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)(x)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并采用向空白組織中添加目標(biāo)化合物的方法, 依據(jù)色譜峰信噪比S/N gt; 3 計(jì)算方法檢出限,S/N gt; 10計(jì)算方法定量限(表1).結(jié)果顯示，4種抗氧化劑在5～100 μg/mL其線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998，其檢出限(LOD)分別為 0.6～1.0 mg/kg(油脂樣品)和0.3～0.5 mg/kg(油炸樣品)，定量限(LOQ)為2～3 mg/kg(油脂樣品)和1～1.7 mg/kg(油炸樣品).

表1 線(xiàn)性方程、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.4方法的回收率和精密度

向2種空白基質(zhì)中分別添加20,40,60 mg/kg(油脂樣品)和10,20,30 mg/kg(油炸樣品)3個(gè)添加水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種質(zhì)量濃度平行測(cè)定6次(表2).結(jié)果表明，上述4種抗氧化劑的平均回收率為80.3%～94.0%(油脂樣品)和80.3%～93.4%(油炸樣品)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.22%～8.80%(油脂樣品)和2.74%～9.62%(油炸樣品)，方法定性、定量準(zhǔn)確.

2.5實(shí)際樣品分析

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同油脂(花生油、玉米油、大豆油、色拉油)和油炸食品(江米條、方便面、油炸薯片、油炸花生、怪味胡豆)中的4種常見(jiàn)酚類(lèi)抗氧化劑的含量.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米油和色拉油中含有BHT，含量分別為5.69 mg/kg和7.82 mg/kg，油炸花生和怪味胡豆中均含有TBHQ，含量分別為34.2 mg/kg和27.5 mg/kg，其含量均低于GB 2760-2007制定的食品中抗氧化劑的最高殘留限量40 mg/kg(BHT，BHA，TBHQ)和10 mg/kg(PG).

表2 加標(biāo)油脂和油炸樣品的測(cè)定

3 結(jié)論

建立的GPC-SPE-HPLC法可同時(shí)測(cè)定油脂及油炸食品中4種酚類(lèi)抗氧化劑.具有樣品檢測(cè)限低、靈敏度高、選擇性好和自動(dòng)化水平較高等特點(diǎn)，為今后對(duì)這4種酚類(lèi)抗氧化劑的檢測(cè)提供了一種有效方法，可保證油脂及油炸食品中4種酚類(lèi)抗氧化劑的定性和定量分析.

[1] AOAC Oficial Method 938.15,Phenolic Antioxidants in Oils, Fats and Butter Oil Liquid Chromatographic Method[S].

[2] KAROVICOVA J, SIMKO P.Determination of synthetic phenolic antioxidants in food by high performance liquid chromatography [J].J Chromatogr A, 2000, 882(1-2): 271-281.

[3] 周建科，宋歌，劉瑞英，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中尼泊金酯類(lèi)防腐劑和特丁基對(duì)苯二酚[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，30(4)：385-388.

ZHOU Jianke,SONG Ge,LIU Ruiying,et al.Determination of TBHQ and nispagin esters in cosmetics using high performance liquid chromatography[J].Journal of Hebei University: Natural Science Edition,2010,30(4):385-388.

[4] 劉年豐，涂一名，夏虹，等.高效液相色譜法測(cè)定油脂中抗氧化劑BHA、TBHQ[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(6)：549-551.

LIU Nianfeng, TU Yiming, XIA Hong,et a1.Determination of antioxidants BHA and TBHQ in oil and fat by high performance liquid chromatography[J].Journal Of Analytical Science,2003,19(6):549-55l.

[5] MARCATO B,GUERRA S,VIANELLO M, et al.Migration of antioxidant additives from various polyolefinic plastics into oleaginous vehicles[J].International Journal of Pharmaceutics,2003,257(1/2):217-225.

[6] 周建科，張前莉，韓康，等.油炸食品中兩類(lèi)酚類(lèi)抗氧劑的反相高效液相色譜法測(cè)定[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27(7)：166-168.

ZHOU Jianke, ZHANG Qianli, HAN Kang,et al.Determination of two phenolic antioxidants in fried foods by the reversed-phase HPLC[J].Food Research and Development,2006,27(7):166-168.

[7] FRANCISCO M L D,RESURRECCION A V A.Development of a reversed-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC) procedure for the simultaneous determination of phenolic compounds in peanut skin extracts[J].Food Chemistry,2009, 117(2):356-363.

[8] YANG M H, LIN H J, CHOONG Y M.A rapid gas chromatographic method for direct determination of BHA ,BHT and TBHQ in edible oils and fats[J].Food Res Int,2002, 35(7):627-633.

[9] 劉紅河，陳衛(wèi)，康莉，等.氣相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中3種抗氧化劑[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，33(12)：2307-2309.

LIU Honghe, CHEN wei, KANG Li,et al.Simultaneous determination of BHA,BHT and TBHQ in foods by gas chromatography with FID[J].Modem Prevention Medicine,2006，33(12):2307-2309.

[10] ZHANG Weiya, WU Caiying, WANG Chengyun, et al.Determination of antioxidants butylated hydroxyanisole(BHA) and butylated hydroxytoluene(BHT) in cosmetics by gas chromatography-mass spectrometry selected ion method[J].Chinese Journal of Chromatography,2002,20(2):178-18l.

[11] 張偉亞，吳采櫻，王成云，等.氣相色譜-質(zhì)譜選擇離子法測(cè)定化妝品中抗氧化劑丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯[J].色譜.2002.20(2)：178-181.

JEON D H,PARK G Y,KWAK I S, et al.Antioxidants and their migration into food simulants on irradiated LLDPE film[J].LWT Food Science and Technology,2007,40(1): 151-156.

[12] MINUTI L,PELLEGRINO R.Determination of phenolic compounds in wines by novel matrix solid-phase dispersion extraction and gas chromatography/mass spectrometry [J].Journal of Chromatography A,2008,1185(1):23-30.

[13] LEE M, LIN C, LI Z, et al.Simultaneous analysis of antioxidants and preservatives in cosmetics by supercritical fluid extraction combined with liquid Chromatography-mass spectrometry [J].Journal of Chromatography A,2006, 1120(1/2): 244-251.

(責(zé)任編輯：梁俊紅)

DeterminationofphenolicantioxidantsinoilandfriedfoodsbyGPC-SPE-HPLC

SHENShi-gang1,SONGWei1，SHARun-jia1,LIHui1,2,ZHANGJing-xuan2

(1.College of Chemistry and Environmental Science, Key Laboratory of Medical Chemistry and Molecular Diagnosis, Hebei University, Baoding 071002，China；2.Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050051,China)

A method has been developed for the determination of four phenolic antioxidants, namely propyl gallate(PG),tertiary butylhydroquinone(TBHQ), butylated hydroxyanisole (BHA) and butylated hydroxytoluene (BHT) in oil and fried foods by gel permeation chromatography’solid phase extraction-high performance liquid chromatograph(GPC-SPE-HPLC).The sample was extracted with cyclohexane/ethyl acetate mixture (1∶1,V/V) and acetonitrile on a vortex mixer, cleaned up through gel permeation chromatography and follow a further HLB solid phase extraction, eluted by the mobile phase of acetonitrile-water containing 0.1% formic acid with BDS HYPERSIL C18 column as the separation column, the eluents were determined by HPLC at wavelength of 280nm using ultraviolet detector.The limits of detection (LOD) was 0.6-1.0 mg/kg(oil) and 0.30-0.50 mg/kg (fried foods), the limits of quantification (LOQ) was 2.0-3.0 mg/kg(oil) and 1.0-1.7 mg/kg (fried foods), the calibration curves showed good linearity with correlation coefficients larger than 0.998,the mean recoveries were in the range of 80.3%-94.0%(oil) and 80.3%-93.4%(fried foods), and accordingly the relative standard deviation ranged from 3.22%-8.80%(oil) and 2.74%-9.62% (fried foods).The method is of high sensitivity, low detection limit, good determination, and can be used to accurately determine four phenolic antioxidants in oil and fried foods.

GPC; SPE; HPLC; phenolic antioxidants; oil and fried foods

O657.7

A

1000-1565(2012)01-0042-05

2011-10-15

河北省平臺(tái)建設(shè)與基礎(chǔ)研究重點(diǎn)計(jì)劃項(xiàng)目(09965120D)

申世剛(1964-),男,河北阜城人，河北大學(xué)教授,主要從事食品安全、化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方向研究.

E-mail:Shenrq@yahoo.com.cn