叢建民，沈海龍，李玉花，張 鵬，楊 玲，黃 劍

(1 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040;2 白城師范學(xué)院生物系，吉林白城 137000;3 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040;4東北林業(yè)大學(xué)，林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040）

植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Somatic embryogenesis)具有普遍性、兩極性、遺傳穩(wěn)定性等特點(diǎn)，通過生產(chǎn)體胚苗可以為優(yōu)良品系大規(guī)?？焖贌o性繁殖和建立植物生物學(xué)研究提供高效試驗(yàn)體系［1］.水曲柳Fraxinus mandshurica屬于木犀科白蠟樹屬大喬木用材和觀賞樹種.建立其體胚發(fā)生體系，對快速擴(kuò)繁其優(yōu)良品系和進(jìn)行其發(fā)育生物學(xué)、遺傳轉(zhuǎn)化研究均具有重要意義.我們的系列研究［2-8］證明，水曲柳體胚發(fā)生最適宜的外植體材料是剛進(jìn)入子葉期的幼嫩合子胚的子葉;但是在水曲柳體胚誘導(dǎo)過程中，體胚的發(fā)生基本上都伴隨著外植體的褐化，而且幼胚子葉外植體表現(xiàn)為多種狀態(tài)類型，如褐化發(fā)生體胚、未褐化發(fā)生體胚等.體胚發(fā)生過程中外植體不同的狀態(tài)類型是其各種內(nèi)在的生理生化反應(yīng)和基因表達(dá)調(diào)控的外在綜合體現(xiàn)，發(fā)掘和認(rèn)識這種內(nèi)在變化與外在表觀類型之間的內(nèi)在聯(lián)系，可以為解析體胚發(fā)生機(jī)理和改善體胚發(fā)生技術(shù)提供科學(xué)依據(jù).本研究針對水曲柳體胚發(fā)生過程中各種狀態(tài)外植體的一些生理生化指標(biāo)進(jìn)行檢測，以期從生理生化角度對各種狀態(tài)類型外植體與水曲柳體胚發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行解析，為提高水曲柳體胚發(fā)生技術(shù)提供理論依據(jù)，并為木本植物體胚發(fā)生的研究提供一個(gè)可能的新的切入點(diǎn).

1 材料與方法

1.1 不同狀態(tài)類型外植體材料的獲得

水曲柳體胚發(fā)生的外植體采集和體胚誘導(dǎo)等按照本研究組前期研究確定的成熟方案［2-8］進(jìn)行.誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基為MS1/2(將MS培養(yǎng)基所有成分都減半)，添加水解酪蛋白(CH)400 mg·L－1，蔗糖70 g·L－1，BA 0.5 mg·L－1，NAA 1.5 mg·L－1，瓊脂 6 g·L－1，添加瓊脂前調(diào)節(jié)pH至5.8，然后120℃高壓滅菌20 min.培養(yǎng)室的溫度控制在25℃，濕度60% ～70%之間.

2009年7月14日，在東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場內(nèi)，從不同母樹上采取水曲柳未成熟種子(受粉后9周左右，子葉形胚初期).將種子去翅，置于蒸餾水中浸泡12 h后，再在流水下沖洗2 h;在超凈工作臺(tái)中用φ為70%的乙醇處理10 s，20 mg·L－1的次氯酸鈉消毒10 min，用無菌水沖洗4～5次.將種子胚根端切去1/3～1/2后擠出幼胚，取單片子葉接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(子葉內(nèi)側(cè)附于培養(yǎng)基上)，每皿接種10個(gè)外植體.接種后的培養(yǎng)皿放入紙箱中暗培養(yǎng).4周后將外植體轉(zhuǎn)接到相同新鮮培養(yǎng)基上.培養(yǎng)45 d時(shí)取不同狀態(tài)類型外植體用作生理生化檢測試驗(yàn)材料.

外植體狀態(tài)類型包括:褐化外植體發(fā)生體胚(HT)、未褐化外植體發(fā)生體胚(WT)、褐化外植體發(fā)生愈傷組織(HY)、未褐化外植體發(fā)生愈傷組織(WY)、褐化外植體長大(HD)、未褐化外植體長大(WD)、褐化外植體未長大(HW)、未褐化外植體未長大(WW).

1.2 生理生化指標(biāo)測定方法

可溶性多糖含量的測定用蒽酮法［9］.可溶性蛋白含量測定用考馬斯亮蘭G-250法［10］，以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量比(mg·g－1).超氧化物歧化酶(SOD)活性測定用氯化硝基四氮哇藍(lán)法［11］.過氧化物酶(POD)活性測定用 Kochba法［12］.過氧化氫酶(CAT)活性測定采用過氧化氫還原法，參考陳建勛［13］方法進(jìn)行測定，多酚氧化酶(PPO)活性參照羅曉芳等［14］的方法測定.均重復(fù)3次，取平均值.

運(yùn)用Spss 10.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，Excel軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 水曲柳體胚發(fā)生的合子胚子葉外植體總體變化

培養(yǎng)中觀察水曲柳合子胚子葉外植體狀態(tài)，在3～5 d微增大，顏色變深，表面有褐色斑形成，10 d左右在外植體邊緣或切口處有大量的愈傷組織產(chǎn)生，有少量的體胚出現(xiàn)在外植體褐化部位，這時(shí)的體胚多數(shù)處于球形胚狀態(tài).20 d開始，愈傷組織明顯長大，而體胚的數(shù)量也開始顯著增加.培養(yǎng)30 d后，有些愈傷組織呈現(xiàn)出粘稠狀非胚性愈傷組織(即使是愈傷組織的狀態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)也不會(huì)出現(xiàn)體胚)，有一些愈傷組織呈現(xiàn)疏松顆粒狀，為胚性愈傷組織(經(jīng)過繼續(xù)培養(yǎng)，會(huì)有體胚出現(xiàn)).褐化的外植體占總狀態(tài)的78.67%，體胚發(fā)生率為11.36%.其中，褐化外植體上體胚(HT)發(fā)生率為8.15%，明顯高于未褐化外植體上體胚(WT)發(fā)生率3.21%的水平.

2.2 不同狀態(tài)類型外植體的多糖含量變化

由圖1A可以看出，水曲柳體胚發(fā)生過程中，不同狀態(tài)類型外植體的多糖含量之間存在顯著差異(P＜0.05).未褐化未長大(WW)外植體中多糖含量最高，褐化長大(HD)外植體次高，褐化發(fā)生體胚(HT)外植體中多糖含量最低，其他長大或發(fā)生愈傷組織外植體居中.這個(gè)格局表明，外植體長大、褐化、發(fā)生愈傷組織和發(fā)生體胚等均消耗組織內(nèi)的多糖，其中以褐化并發(fā)生體胚的外植體多糖消耗的數(shù)量最多.說明在水曲柳體胚發(fā)生過程中，外植體內(nèi)部的多糖類物質(zhì)被降解、轉(zhuǎn)化、代謝，以便為生長分化提供能量.需要注意的是外植體褐化本身也會(huì)消耗多糖.

2.3 不同狀態(tài)類型外植體的可溶性蛋白含量變化

圖1B結(jié)果表明，不同狀態(tài)類型的外植體的可溶性蛋白含量之間存在著顯著差異(P＜0.05).未褐化發(fā)生體胚(WT)外植體的可溶性蛋白含量最高，其次為未褐化長大(WD)和未褐化發(fā)生愈傷組織(WY)外植體.而褐化未長大(HW)、褐化長大(HD)、褐化發(fā)生體胚(HT)和褐化發(fā)生愈傷組織(HY)的外植體中可溶性蛋白的含量明顯低于前三者未褐化的外植體.但是，未褐化未長大(WW)的外植體中可溶性蛋白的含量也很低，顯著低于其他未褐化的類型.

2.4 不同狀態(tài)類型外植體的SOD活性變化

圖1C結(jié)果表明，水曲柳體胚發(fā)生過程中，不同狀態(tài)類型的外植體中SOD活性是不同的，且差異顯著(P＜0.05).未褐化發(fā)生愈傷組織(WY)外植體中SOD活性最高，其次為褐化發(fā)生愈傷組織(HY)和未褐化發(fā)生體胚(WT)的外植體，褐化長大(HD)、褐化發(fā)生體胚(HT)和褐化未長大(HW)外植體的第3，未褐化未長大(WW)和未褐化長大(WD)外植體的SOD活性最低.由此可見，水曲柳體胚發(fā)生過程中，愈傷組織的發(fā)生與外植體中的SOD活性有直接的關(guān)系，而體胚發(fā)生與外植體SOD活性關(guān)聯(lián)不大.

2.5 不同狀態(tài)類型外植體的POD活性變化

圖1D中可以看出，水曲柳體胚發(fā)生過程中，不同狀態(tài)類型的外植體中POD活性存在顯著差異(P＜0.05).各個(gè)褐化外植體中的POD活性均顯著低于各個(gè)未褐化外植體的POD活性.褐化發(fā)生體胚(HT)的外植體中POD活性略高于其他褐化的外植體的POD活性，而未褐化發(fā)生體胚(WT)的外植體中POD活性卻小于其他未褐化的外植體的POD活性.未褐化長大(WD)的外植體中的POD活性最高，未褐化發(fā)生愈傷組織(WY)和未褐化未長大(WW)的外植體中POD活性次高，即未褐化的外植體中，單純體積長大的類型中的POD活性最高，而發(fā)生愈傷組織或體胚，POD活性就降低;但是沒有發(fā)生任何變化(WW)的外植體的POD活性也較低.

圖1 水曲柳體胚發(fā)生過程中各狀態(tài)類型外植體的不同生理指標(biāo)變化Fig.1 Physiological index changes in different types of explants during somatic embryogenesis of Fraxinus mandshurica

2.6 不同狀態(tài)類型外植體的CAT活性變化

圖1E結(jié)果表明，水曲柳體胚發(fā)生過程中，不同狀態(tài)類型外植體中的CAT活性有顯著差異(P＜0.05).除了未褐化發(fā)生體胚(WT)外植體的CAT活性極低外，其他未褐化的外植體中CAT活性均很高，其中未褐化未長大(WW)和未褐化發(fā)生愈傷組織(WY)外植體的CAT活性最高，未褐化長大(WD)的次之.褐化的外植體中CAT活性均很低，其中褐化長大(HD)、褐化發(fā)生愈傷組織(HY)和褐化發(fā)生體胚(HT)的外植體中CAT活性極低，顯著低于褐化未長大(HW)的外植體.整體上來看，不管褐化與否，發(fā)生體胚的外植體的CAT活性均極低.

2.7 不同狀態(tài)類型外植體的PPO活性變化

圖1F結(jié)果表明，水曲柳體胚發(fā)生過程中，各不同狀態(tài)類型外植體的PPO活性存在顯著差異(P＜0.05)，但整體上來看，褐化和未褐化外植體的PPO活性均較高.其中，褐化發(fā)生愈傷組織(HY)的外植體的PPO活性明顯高于其他各個(gè)類型的外植體.褐化未長大(HW)和未褐化長大(WD)的外植體中PPO活性最低，其他各種狀態(tài)類型外植體的PPO活性居中.

3 討論與結(jié)論

多糖類物質(zhì)在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的作用主要是提供能量和參與形態(tài)建成.糖類化合物的積累與植物體細(xì)胞胚發(fā)生潛能的實(shí)現(xiàn)是密切相關(guān)的.水曲柳中褐化外植體的體胚發(fā)生能力較未褐化外植體高，也可能與其褐化外植體中糖含量有關(guān).

可溶性蛋白含量與生物體適應(yīng)環(huán)境的調(diào)控有關(guān)，楊和平等［15］在馬唐 Digitaria sanguinalis胚狀體發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胚胎發(fā)生受阻時(shí)，胚性愈傷組織中蛋白質(zhì)合成較旺盛.但在愈傷組織生長過程中可溶性蛋白質(zhì)含量在一段短暫的上升之后有一下降趨勢，這與愈傷組織生長高峰期到來以前所需的蛋白及隨后多轉(zhuǎn)化為貯藏蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān).未褐化產(chǎn)生體胚的外植體中可溶性蛋白含量明顯高于未產(chǎn)生體胚外植體，可能是由于胚性細(xì)胞的代謝較非胚性細(xì)胞旺盛，因此在從培養(yǎng)基中獲得了有機(jī)與無機(jī)成分以后及時(shí)將其轉(zhuǎn)化成能量和細(xì)胞物質(zhì)，積累了蛋白質(zhì)，以備細(xì)胞分化之用［16］.但是在未褐化的4種外植體中，卻是未褐化未長大的外植體蛋白含量最低，褐化外植體間的蛋白含量變化差異不大，推測可能是由于調(diào)控外植體褐化與否的細(xì)胞內(nèi)部基因表達(dá)發(fā)生變化，從而影響了蛋白的合成.

植物體細(xì)胞胚發(fā)生和發(fā)育過程中抗氧化酶活性研究已有報(bào)道［17］，研究枸杞Lycium barbarum體細(xì)胞胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，SOD、POD和CAT相互配合來調(diào)節(jié)胚性細(xì)胞的分化和發(fā)育，這3種酶在胚胎發(fā)生與發(fā)育過程中具有特異性變化，表明體細(xì)胞胚胎發(fā)生與超氧化物對自由基的清除有關(guān)，認(rèn)為體細(xì)胞胚發(fā)生及發(fā)育是大量酶特異性合成及參與代謝的結(jié)果.體細(xì)胞胚發(fā)生過程中活性氧的變化與體細(xì)胞胚的發(fā)生發(fā)育密切相關(guān)，因此其SOD活性也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化.據(jù)報(bào)道，SOD活性的增加與細(xì)胞分化頻率成正比，對胚性細(xì)胞的分化以及胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用［18-19］.有關(guān)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中SOD活性的報(bào)道很有限，而且其中大多也是有關(guān)胚性和非胚性組織的.崔凱榮等［18］認(rèn)為在胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后，隨著胚性細(xì)胞的形成，SOD活性逐漸升高，當(dāng)胚性細(xì)胞進(jìn)一步分裂形成體細(xì)胞胚時(shí)，SOD活性達(dá)到最高峰，表明SOD活性升高對胚性細(xì)胞的分化及胚胎發(fā)育具有促進(jìn)作用.這與本試驗(yàn)結(jié)果有相似之處.此外，0berle等［19］也認(rèn)為，具分生組織的莖尖和根尖的SOD活性較高，即只有SOD活性升高，分化才會(huì)發(fā)生［20］.H2O2是一種比較強(qiáng)的氧化劑，在植物體中存在和積累可導(dǎo)致破壞性的氧化作用，能將生物大分子的有關(guān)活性基團(tuán)氧化，使生物大分子鈍化，甚至完全失去生物活性.一般認(rèn)為，體內(nèi)的CAT活性與該器官的代謝強(qiáng)弱有密切關(guān)系，代謝強(qiáng)，產(chǎn)生的H2O2等副產(chǎn)物較多，CAT活性就高.過氧化氫酶是植物體內(nèi)重要的活性氧消除系統(tǒng)成分之一，可以清除H2O2.據(jù)報(bào)道，CAT活性與植物抗逆性有關(guān)，與植物老化也有一定的關(guān)系，在老化的組織中其活性較強(qiáng)［21］.很多學(xué)者都以CAT活性變化來研究植物的生長發(fā)育和進(jìn)行植物的選育.

外植體褐化的機(jī)制是外植體在受損傷時(shí)，液泡中的酚類物質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)中的PPO接觸后，被氧化成相應(yīng)的醌，再進(jìn)一步反應(yīng)形成黑色或褐色的色素沉淀［22］.單一的多酚氧化酶活性和多酚含量并不能說明褐變的機(jī)理，多酚和多酚氧化酶在細(xì)胞內(nèi)存在區(qū)域化分布，形成酚和酶的區(qū)域化分布的膜系統(tǒng)才是褐變發(fā)生的關(guān)鍵［14］.組織培養(yǎng)過程中的褐變現(xiàn)象已經(jīng)成為影響組培成功的重要因素.褐變現(xiàn)象主要是由多酚氧化酶(PPO)作用于天然底物酚類物質(zhì)而引起的.組織培養(yǎng)中外植體酚類物質(zhì)的含量與其褐變率成正相關(guān)，與成活率成負(fù)相關(guān)［20］.現(xiàn)在許多報(bào)道認(rèn)為POD是一種誘導(dǎo)酶，外界因素通過POD系統(tǒng)影響器官的生理變化和個(gè)體發(fā)育，其酶活力和同工酶的變化可能與一些高等植物的發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)［21］.在胚胎發(fā)生發(fā)育中相應(yīng)的基因在時(shí)間和空間上順序表達(dá)，有舊酶的消失和新酶的產(chǎn)生.POD同工酶也是較好的遺傳信息表達(dá)的標(biāo)志，它的合成受一系列基因所調(diào)控［22］.

本文以水曲柳幼嫩合子胚子葉為外植體誘導(dǎo)水曲柳體胚發(fā)生，檢測這些不同狀態(tài)類型外植體的多糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量及 SOD、POD、CAT、PPO活性等生理生化指標(biāo).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同狀態(tài)類型外植體的生理生化狀態(tài)與體胚發(fā)生、愈傷組織發(fā)生、外植體褐化和生長發(fā)育存在非常有趣的相關(guān)關(guān)系，值得進(jìn)一步通過分子生物學(xué)方法加以驗(yàn)證、解析.

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