張秀娟，李 莉，衛(wèi)恒習，白銀山，師如意，張守全

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州 510642）

在哺乳動物睪丸內(nèi)，精子發(fā)生是一個受高度調(diào)控和持續(xù)的過程:精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)一方面進行自我更新維持干細胞數(shù)量，另一方面又不斷執(zhí)行分化生成各級生精細胞直至最后生成精子［1-2］.SSCs定居在曲精細管上皮的基膜處，是哺乳動物精子發(fā)生的最原始細胞，也是動物體內(nèi)唯一能將遺傳信息傳遞的干細胞［3］.精原干細胞體外培養(yǎng)體系的建立，在SSCs生物學、醫(yī)學、畜牧業(yè)生產(chǎn)及制備轉(zhuǎn)基因動物等領域具有廣闊的應用前景，然而SSCs在成年哺乳動物睪丸中的數(shù)量非常低，據(jù)報道1只成年公鼠睪丸內(nèi)只有約2×104～3×104個被稱為 Asingle(As)的精原細胞［4-5］，因此建立SSCs的體外培養(yǎng)體系是開展其各方面研究的重中之重.研究表明，不但在不同物種間SSCs體外培養(yǎng)特性存在共性和差異，即使相同物種而遺傳背景不同SSCs體外培養(yǎng)也有差異，如同一培養(yǎng)條件對不同品系來源SSCs體外增殖的影響有很大差異［6］，建立的培養(yǎng)體系能支持 ICR或 C57BL/6×DBA/2 F1(BDF1)遺傳背景的小鼠SSCs的體外增殖，但不支持C57BL/6和129/Sv遺傳背景的小鼠SSCs.甚至小鼠不同品系 SSCs培養(yǎng)對生長因子的需求都不同［7］，DBA/2小鼠的 SSCs在體外培養(yǎng)時，僅添加膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)就能維持其長期增殖，而其他品系小鼠SSCs在體外的長期自我復制還需要其他生長因子.這些體外培養(yǎng)研究提示著遺傳背景是影響SSCs增殖的重要因素之一，最新研究表明小鼠的遺傳背景也會參與調(diào)控體內(nèi)SSCs的自我更新［8］，將不同供體小鼠的SSCs移植到經(jīng)白消安處理的受體曲精細管內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其中DBA/2遺傳背景與C57BL/6遺傳背景相比，其SSCs在受體睪丸內(nèi)增殖較快且數(shù)量較多.因MTT法可同時反映細胞數(shù)量和活力，近年來被廣泛地應用在細胞增殖的檢測中［9-10］.昆明小鼠因遺傳多樣性、繁殖性能快等優(yōu)點，目前是生命科學研究領域的重要模式動物之一，尤其在生殖與發(fā)育生物學方面，然而昆明小鼠SSCs增殖的體外培養(yǎng)體系對生長因子的需求還不完全清晰，因此本研究分離培養(yǎng)了昆明小鼠SSCs，采用MTT法檢測其不同生長因子及其添加濃度對SSCs體外增殖的影響，從而建立一種簡單有效的增殖SSCs培養(yǎng)體系.

1 材料與方法

1.1 研究對象與主要試劑

5～7 d的雄性昆明小鼠，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心.Ⅳ型膠原酶、DNA酶Ⅰ和0.25%胰酶 －EDTA為Sigma公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FCS)等為Gibco公司產(chǎn)品，Percoll液為Pharmacia公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍(MTT)為Amresco公司產(chǎn)品;重組小鼠堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和重組大鼠 GDNF(rrGDNF)為R＆D公司產(chǎn)品，鼠白血病抑制因子(murine leukemia inhibitory factor，LIF)為Chemicon公司產(chǎn)品.

1.2 SSCs的分離與純化

兩步酶消化法［11］獲得曲精細管細胞懸液.先用1 g/LⅣ型膠原酶和20 μg/mL DNAseⅠ聯(lián)合消化，600 r/min離心5 min，收集曲精細管，再用0.25%胰酶-EDTA 和20 μg/mL DNAaseⅠ消化.用4 g/L臺盼蘭拒染法檢測細胞活率≥90%.

差速貼壁法，將細胞懸液接種至2 g/L明膠包被的培養(yǎng)瓶，首次差速貼壁時間為6～8 h，轉(zhuǎn)移到新的2 g/L明膠包被的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)差貼8～10 h，第3次轉(zhuǎn)移后培養(yǎng)過夜，即獲得純化的SSCs.

Percoll不連續(xù)密度梯度法，按9 g/L無菌生理鹽水∶Percoll原液體積比為1∶9比例配成φ為90%的Percoll母液，梯度設置見表1.

表1 Percoll不連續(xù)密度梯度的組成Tab.1 Composition of Percoll discontinuous density gradients

1.3 小鼠支持細胞(MSC)飼養(yǎng)層的準備

繼續(xù)培養(yǎng)首次差速貼壁后的體細胞，體外傳代培養(yǎng)至穩(wěn)定，形態(tài)學觀察約大于95%的細胞屬支持細胞，取穩(wěn)定培養(yǎng)的F3～F6，經(jīng)10 μg/mL的絲裂霉素C處理制作飼養(yǎng)層.

1.4 SSCs的純化率鑒定

因SSCs具有堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)活性［7］，而分化的和體細胞不具有此特性，制作細胞涂片，做AP活性染色鑒定，每次涂片選取n個(n≥3)視野，計算染色細胞數(shù)目占總細胞數(shù)目的比率，每種純化方法，重復3次.

1.5 MTT法檢測生長因子對SSCs體外培養(yǎng)增殖的效果

SSCs培養(yǎng)液是 DMEM液，并添加 55 μmol/L 2－巰基乙醇，2 mmol/L L－谷氨酰胺，30 μg/mL丙酮酸鈉，必需氨基酸(φ為1%)，非必需氨基酸(φ為1%)，維生素溶液(φ 為 1%)，φ 為 5%FCS，20 ng/mL bFGF因子，20 ng/mL GDNF因子，103U/mL LIF因子，φ為1%的雙抗.

將純化的SSCs調(diào)整細胞密度至2×105mL－1，接種至MSC飼養(yǎng)層上，每孔接種200 μL;每個處理組設置4個重復(分組情況見表2)，對照組無生長因子添加，分別與體外培養(yǎng)3、5和7 d的同一時間點，顯微鏡下觀察細胞的生長，MTT法檢測細胞增殖情況.

1.6 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用EXCEL和SPSS 14.0統(tǒng)計分析.

表2 LIF、GDNF、bFGF 3種生長因子不同組合濃度的分組Tab.2 Groups of LIF，GDNF，bFGF factors in different combination concentrations

2 結(jié)果與分析

2.1 5日齡小鼠和7日齡小鼠SSCs的分離效果分析

小鼠出生后睪丸組織細胞增殖很快，發(fā)現(xiàn)5日齡和7日齡其睪丸組織消化效果有很大差異(表3)，7日齡小鼠在細胞總數(shù)、多細胞團率以及多次共貼壁率方面都顯著高于5日齡的(P＜0.05)，且7日齡小鼠睪丸細胞活力較高，但從獲得更多的SSCs來看，2個日齡無顯著差異(P＞0.05).

表3 兩步酶消化法對兩組鼠齡睪丸組織分離效果分析1)Tab.3 Isolation result analysis of two groups of pup mouse testes by two-step enzymatic digestion method

2.2 兩種SSCs純化方法效果的比較

從圖1可明顯看出，多次差速貼壁法在純化后細胞占純化前細胞總量的回收細胞比率(20.10%vs.13.94%)和AP 陽性率(85.06%vs.81.82%)都高于Percoll不連續(xù)密度梯度法，盡管兩者無統(tǒng)計意義上的顯著差異(P＞0.05)，但多次差速貼壁法因操作相對簡便而被選擇應用在后續(xù)的研究中.

圖1 兩種SSCs純化方法的結(jié)果比較Fig.1 Results comparison of two purification methods

2.3 LIF因子對SSCs的增殖作用

MTT法檢測結(jié)果表明，LIF的添加組在培養(yǎng)的3和5 d時，無明顯促進，而在培養(yǎng)的7 d后，與對照組相比有顯著的促增殖作用(P＜0.05，圖2).

2.4 GDNF、bFGF和LIF三因子組合對SSCs增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果(圖3)及細胞形態(tài)學觀察結(jié)果(圖4)表明，GDNF、bFGF和103U/mL LIF 3種因子不同質(zhì)量濃度組與對照組相比，在培養(yǎng)的3、5和7 d的增殖效應都顯著高于對照組(P＜0.05)，尤其是20 ng/mL bFGF、20 ng/mL GDNF 和 103U/mL LIF組，在培養(yǎng)的7 d后，促增殖效應顯著高于其他質(zhì)量濃度添加組(P＜0.05).

圖2 LIF因子添加對原代小鼠SSCs增殖的影響Fig.2 Effects of LIF factor on primary SSCs proliferation

圖3 MTT法檢測GDNF、bFGF和LIF組合對原代小鼠SSCs增殖的影響Fig.3 Effect of three factors of GDNF，bFGF and LIF on primary SSCs proliferation by MTT method

圖4 GDNF、bFGF和LIF組合添加培養(yǎng)原代SSCs的形態(tài)學觀察Fig.4 Morphology observation of primary SSCs at day 5 in vitro culture with three factors of GDNF，bFGF and LIF

3 討論

小鼠的年齡會影響睪丸中SSCs的活性，一般采用幼年的動物為研究對象.新生鼠睪丸中SSCs純度高且無分化型精原細胞，但是細胞數(shù)量相對來說很少［5，12］.幼齡小鼠因富含 SSCs［7，13］和較高的細胞活性［14］而成為理想的試驗材料，7日齡的小鼠睪丸細胞總數(shù)約是5日齡的3～4倍，SSCs的總數(shù)只是略多，卻無統(tǒng)計意義上的顯著差異，小鼠出生后的幾天內(nèi)，生殖母細胞繼續(xù)增殖發(fā)育成SSCs，SSCs緩慢增殖維持著干細胞的數(shù)量和功能.

不連續(xù)密度梯度法和差速貼壁法都是簡單有效的方法，資料報道，Percoll密度梯度法和BSA梯度法可獲得較為純化的小鼠 SSCs，其純度大約從68.76% ～90%不等［15-16］，本試驗Percoll密度梯度法純化5～7 d的昆明小鼠SSCs，在35% ～45%處獲得SSCs，其純度達到平均81.82%.利用睪丸內(nèi)支持細胞和間質(zhì)細胞在體外能較快貼壁生長的特點，多次差速貼壁后獲得平均為85.06%的純化率.同時，研究表明少量體細胞作為SSCs生長的微環(huán)境可支持體外短期生長和特性維持［17］.利用多次差速貼壁方法成功獲得遺傳背景分別為DBA/2和ICR的小鼠SSCs體外至少6個月的長期穩(wěn)定增殖［18-19］.

GDNF促進體外培養(yǎng)的SSCs自我更新，主要通過Ras信號通路最終上調(diào) C-fos的表達［20］和 Src信號通路最終上調(diào)N-Myc的表達來實現(xiàn)［21］.GDNF和bFGF 2種因子同時添加對多種遺傳背景的小鼠SSCs體外培養(yǎng)增殖具有協(xié)同效應［7，22-23］，本試驗結(jié)果證明該效果.昆明小鼠SSCs的體外培養(yǎng)bFGF單獨添加，較對照組顯著促進了SSCs的增殖，形成小克隆簇(結(jié)果未顯示)，同時bFGF因子是PGCs體外培養(yǎng)的一關鍵生長因子，兩者是有連續(xù)的，有相似之處.研究表明bFGF通過自分泌方式能夠促使GDNF和GFRα1的生成，從而降低了神經(jīng)細胞的凋亡［24］，這或許提示著bFGF在SSCs體外自我更新和增殖當中，能夠通過這種方式或通過某些信號通路從而和GDNF有協(xié)同作用.

LIF因子對SSCs的作用方式和途徑目前尚未完全清楚，盡管LIF因子對小鼠SSCs的克隆形成和體外增殖無顯著作用［23］，但諸多已建立的小鼠SSCs體外培養(yǎng)體系，培養(yǎng)基含LIF因子或使用分泌LIF因子的 MEF 飼養(yǎng)層等［6，18，22］.目前的研究主要集中在細胞形態(tài)學觀察、體外培養(yǎng)或移植后克隆形成數(shù)量來評價LIF因子的作用，本試驗通過MTT法，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的7 d，單因子添加LIF組比對照組SSCs活細胞數(shù)量顯著增多，并且LIF因子和GDNF、bFGF具有組合效應，對SSCs的增殖具有促進作用，但通過細胞形態(tài)學觀察無明顯區(qū)別，這可能是MTT法對活細胞數(shù)量檢測的客觀精確性，LIF因子對SSCs體外培養(yǎng)的作用有待進一步的揭示.

［1］SCCLATT S.Spermatogonial stem cell preservation and transplantation［J］.Mol Cell Endocrinol，2002，187(1/2):107-111.

［2］DE ROOIJ D G.Proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells［J］.Reproduction，2001，121:347-354.

［3］OGAWA T，OHMURA M，YUMURA Y，et al.Expansion of murine spermatogonial stem cells through serial transplantation［J］.Biol Reprod，2003，68(1):316-322.

［4］MEISTRICH M L，VAN BEEK M E.Spermatogonial stem cells:Assessing their survival and ability to produce differentiated cells［J］.Methods Toxicol，1993，3(A):106-123.

［5］DE ROOIJ D G.Stem cells in the testis［J］.Int J Exp Pathol，1998，79(2):67-80.

［6］KANATSU-SHINOHARA M，OGONUKI N，INOUE K，et al.Long term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells［J］.Biol Reprod，2003，69(2):612-616.

［7］KUBOTA H，AVARBOCK M R，BRINSTER R L.Culture conditions and single growth factors affect fate determination of mouse spermatogonial stem cells［J］.Biol Reprod，2004，71(3):722-731.

［8］KANATSU-SHINOHARA M，OGONUKI N，MIKI H，et al.Genetic influences in mouse spermatogonial stem cell self-renewal［J］.J Reprod Dev，2010，56:145-153.

［9］LIU Hui，COLLINS S F，SUGGS L J.Three dimensional culture of expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells［J］.Biomaterials，2006，27:6004-6014.

［10］ZHANG Ge，WANG Xiao-hong，WANG Zong-li，et al.A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery［J］.Tissue Eng，2006，12(1):9-19.

［11］KUBOTA H，AVARBOCK M R，BRINSTER R L.Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells［J］.PNAS，2004，101(47):16489-16494.

［12］YOSHIDA S，SUKENO T，NAKAGAWA K，et al.The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage［J］.Development，2006，133(8):1495-1505.

［13］SHINOHARA T，ORWIG K E，AVARBOCK M R，et al.Remodeling of the postnatal mouse testis is accompanied by dramatic changes in stem cell number and niche accessibility［J］.PNAS，2001，98(11):6186-6191.

［14］NAGANO M，RYU B Y，BRINSER C J，et al.Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro［J］.Biol Reprod，2003，68(6):2207-2214.

［15］張學明，賴良學，李德雪，等.小鼠精原細胞的分離和純化［J］.解剖學報，2000，31(3):235-238.

［16］BRAYDICH-STOLLE L，NATALIA K，MARTIN D，et al.Role of Src family kinases and N-Myc in spermatogonial stem cell proliferation［J］.Dev Biol，2007，304(1):34-45.

［17］OATLY M J，RACICOT K E，OATLY J M.Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis［J］.Biol Reprod，2010，84(4):639-645.

［18］OGAWA T，OHMURA M，TAMURA Y，et al.Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell line［J］.Arch Histol Cytol，2004，67(4):297-306.

［19］KANATSU-SHINOHARA M，INOUE K，OGONUKI N，et al.Long term cultureof mouse male germline stem cells under serum or feeder free conditions［J］.Biol Reprod，2005，72(4):985-991.

［20］HE Zu-ping，JIANG Ji-ji，KOKKINAKI M，et al.GDNF up-regulates c-fos Transcription via the Ras/ERK1/2 pathway to promote mouse spermatogonial stem cell proliferation［J］.Stem Cells，2008，26(1):266-278.

［21］LEE J，KANATSU-SHINOHARA M，INOUE K，et al.Akt mediates self-renewal division of mouse spermatogonial stem cells［J］.Development，2007，134(10):1853-1859.

［22］RYU B Y，KUBOTAH，AVARBOCK M R，et al.Conservation of spermatogonial stem cell self-renewal signaling between mouse and rat［J］.PNAS，2005，102(40):14302-14307.

［23］KANATSU-SHINOHARA M，SHINOHARA T.Cultureand genetic modification of mouse germline stem cells［J］.Ann NY Acad Sci，2007，1120(1):59-71.

［24］LENHARD T，SCHOBER A，SUTER-CRAZZOLARA C，et al.Fibroblast growth Factor-2 requires glial-cell-derived neurtrophic factor exerting its neuroprtective actions on glutamate-lesioned hippocampal neurons［J］.Mol Cell Neuro Sci，2002，20(2):181-197.