虞 娉 杭州市腫瘤醫(yī)院 杭州310002

楊 祺 王 宇 廈門博欣生物技術(shù)有限公司

王翠蓮 杭州市紅十字會醫(yī)院藥劑科

比伐盧定是一種人工合成制備的含20個氨基酸的多肽，是凝血酶的二價抑制劑，主要用于心肌梗死急救、心臟手術(shù)、整形外科手術(shù)后深層靜脈血栓的預防等。其序列是：D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Gl u-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。其中氨基端的D-Phe-Pro-Arg-Pro-（Gly）4 區(qū)域與游離型或結(jié)合型凝血酶的催化位點和底物識別位點發(fā)生特異性結(jié)合，直接抑制凝血酶活性，發(fā)揮抗凝治療作用［1-2］。受抑制的凝血酶可以通過切斷Arg-Pro鍵而恢復活性［3］，因此比伐盧定與凝血酶結(jié)合具有特異性及可逆性，其半衰期短，不易出現(xiàn)其它常用的抗凝劑經(jīng)常存在的缺血和出血并發(fā)癥狀況。在國外比伐盧定是臨床上普遍應用的治療心血管疾病的多肽藥物，其生產(chǎn)工藝為化學合成，有片段液相合成法及固相逐步合成法等，但存在操作步驟多，純化復雜、連接效率及產(chǎn)率相對不高的缺點。目前國內(nèi)的原料藥產(chǎn)品仍是進口產(chǎn)品，價格昂貴。筆者研究了比伐盧定的合成路徑及合成條件的優(yōu)化，可作為化學法大量合成比伐盧定的基礎。

1 材料與儀器

Wang樹脂（替代度1.0mmol/g，天津南開合成技術(shù)有限公司），肽鏈中所有保護氨基酸、DCC（化學純，成都凱泰新技術(shù)有限責任公司），HBTU、HOBT、DMAP（化學純，蘇州天馬醫(yī)藥有限公司），DIC（分析純，山東淄博暢順工貿(mào)有限公司），DIEA（化學純，浙江新德化工有限公司）。六氫吡啶、吡啶（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。TFA（化學純，南京普成化工有限公司），EDT（化學純，F(xiàn)luck），DMF（分析純，韓國三星），DCM（分析純，汕頭光華化學廠），無水乙醚（分析純，上海馬陸制藥廠），丙酮（分析純，上?；瘜W試劑總廠），甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯（分析純，重慶川東化工集團有限公司），石油醚60～90℃（分析純，北京長?；S），正己烷（分析純，成都市科龍化工有限公司）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠，RE-2000），美國Waters 600、WatersLC4000高效液相色譜儀，Mariner System 5074質(zhì)譜儀。

2 方法

2.1 固相逐步合成法

2.1.1 固相逐步偶聯(lián) 將Fmoc-Leu-OH 溶于有機溶劑DMF中，用DCC和HOBT做縮合劑，在DMAP的催化下同2g Wang樹脂反應4h 后，用吡啶和醋酐封閉過夜，洗滌干燥后檢測其取代度［4］。

取代度測定：準確稱取干燥后的樹脂7～12mg2份，分別加入3mL 六氫吡啶/DMF（20%體積比）的混合液，同時做1 份空白對照，反應30min。反應完畢后使樹脂沉降，取上清液進行紫外比色。取平均值后代入以下公式計算取代度［5］：取代度（mmol/g）＝（樣品吸收值－參照池吸收值）/（1.65×樹脂毫克數(shù)）。

稱取一定量Fmoc-Leu-Wang樹脂加入反應器中，根據(jù)測定的氨基酸在樹脂上的取代度及樹脂重量，計算保護氨基酸、縮合試劑及DIEA所需量。固相Fmoc保護策略偶聯(lián)反應的一般程序見表1，重復表1步驟直至比伐盧定合成完畢并脫去Fmoc保護基，DMF、甲醇洗滌后晾干待裂解。

表1 固相Fmoc保護策略偶聯(lián)反應的一般程序

2.1.2 肽樹脂的裂解［6］與粗品的純化 將裂解試劑TFA:EDT:苯酚：H2O（95:3:1.5:0.5）加入一定量的樹脂中（裂解液體積為10mL/g 樹脂），避光室溫攪拌2h 后過濾，將濾液倒入預凍的無水乙醚中析出大量白色沉淀，于－20℃冰箱中靜置1h，待上層液變清后離心，傾去上清液，再加適量乙醚洗滌。離心3 次，置沉淀于干燥器中干燥至恒重，即得比伐盧定粗品。

粗品用Waters LC4000 高效液相體系純化（色譜柱：Waters C18（30mm×300mm，15μm）；流動相：乙腈（20:40）-水；流速：10mL/min；檢測波長：210nm；進樣量：1mL），經(jīng)30min梯度洗脫后濃縮，凍干，得比伐盧定純品。取純化后比伐盧定樣品經(jīng)分析型Waters 600E 高效液相體系（反相柱：Waters C18（7.8mm×30mm，5μm；流動相：乙腈（25:40）-水；其余同上）分析，30min梯度洗脫，檢驗其純度，并經(jīng)質(zhì)譜驗證。

2.2 片段液固相合成 Fmoc-Arg（pbf）-OH 溶于DMF/二氯甲烷混合溶劑（PH7-8）中，加入DCC和HOBT二氯甲烷溶液，冰浴攪拌10min，加入Fmoc-Pro-OMe DMF 溶液，冰浴下反應30min后撤掉冰浴，室溫反應2h，濾除不溶物DCU。加入過量的水，用乙酸乙酯提取，檸檬酸和飽和碳酸氫鈉溶液洗滌并用無水硫酸鈉干燥，哌啶脫保護，滴加入冰浴狀態(tài)下DCC和HOBT 活化反應的Fmoc-Pro-OH DMF 溶液中，室溫反應2h后，用檸檬酸和飽和碳酸氫鈉溶液洗滌未反應的原料。產(chǎn)物用NaOH/甲醇脫保護。PE/AcOEt/HAc 重結(jié)晶純化后得純品保護三肽。將純化好的Fmoc-Pro-Arg（pbf）-Pro-OH 片段按照常規(guī)接肽的方法連接到肽樹脂上，再接最后一個氨基酸D-Phe，完成比伐盧定的合成。裂解、純化步驟與固相逐步合成時方法一致。

3 結(jié)果

3.1 替代度對比伐盧定粗肽產(chǎn)率和純度的影響 以HBTU為縮合試劑，分別以取代度為0.32、0.46、0.52mmol/g的Fmoc-Leu-Wang Resin合成比伐盧定，固相逐步合成與片段液固合成的結(jié)果見表2、表3。片段連接時選用替代度為0.46mmol/g的效果與固相逐步連接時選用替代度為0.36mmol/g相當。

表2 固相逐步合成時替代比伐盧定粗肽產(chǎn)率和純度的影響

表3 固液相片段合成時替代比伐盧定粗肽產(chǎn)率和純度的影響

3.2 縮合試劑對比伐盧定粗肽產(chǎn)率和純度的影響 分別以HBTU、DCC、DIC 為縮合試劑，以取代度為0.46mmol/g的Fmoc-Leu-Wang Resin合成比伐盧定，結(jié)果見表4。不同縮合試劑對比伐盧定合成的純度及產(chǎn)率有較明顯的影響。DIC與DCC 為縮合試劑合成的比伐盧定產(chǎn)率和純度都較HBTU高。但在以DCC為縮合試劑合成比伐盧定的過程中，盡管以甲醇多次洗滌，但反應過程中產(chǎn)生的DCU 依然無法完全除去。不僅給操作帶來了不便，也耗費了大量溶劑，增加了成本。因此選擇DIC為縮合試劑較合適。

表4 縮合試劑對比伐盧定粗肽產(chǎn)率和純度的影響（樹脂替代度為0.46mmol/g）

3.3 裂解試劑對比伐盧定粗肽純度的影響 比伐盧定序列中含有許多以tBu 基團保護的氨基酸序列，在用三氟乙酸裂解過程中，容易產(chǎn)生碳正離子而發(fā)生副反應。而EDT是最有效的TFA-tBu酯及Trt清除劑，其次苯酚也具有TFA-tBu酯及tBu-CO+離子清除功能。裂解試劑TFA:EDT:苯酚：H2O為95:3:1.5:0.5時，效果達到最佳，見表5。

表5 裂解試劑對比伐盧定粗肽純度的影響

綜合以上各個條件，考慮到樹脂、溶劑、氨基酸成本及純化的難易，我們選擇了一批氨基酸樹脂重量為30g，替代度為0.46mmol/g的Fmoc-Leu-Wang樹脂，縮合劑為DIC，裂解條件為TFA:EDT:苯酚：H2O（95:3:1.5:0.5），采用片段液固相法合成比伐盧定。得比伐盧定粗品產(chǎn)率為85.4%，純度為71.4%。粗品經(jīng)純化，純度為99.1%。純品質(zhì)譜鑒定，理論值分子量為2180，實測值為2180。HPLC分析條件：乙腈/水（28:40），流速1ml/min，檢測波長215nm。

4 結(jié)論

本文采用片段固液相合成斷開困難點，用替代度為0.46mmol/g的樹脂合成的比伐盧定粗肽產(chǎn)率、純度與固相逐步連接時選用替代度較低的樹脂（0.36mmol/g）相當，不僅提高了效率，而且使合成成本降低。另外，實驗通過對DCC、DIC、HBTU3 種縮合試劑及不同的裂解試劑進行比較發(fā)現(xiàn)，DIC 縮合試劑能克服TBTU 在比伐盧定合成時產(chǎn)率和純度不高、DCC在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的DCU較難除盡且不易操作的缺點；裂解試劑TFA:EDT:苯酚：H2O（95:3:1.5:0.5）能減少三氟乙酸在裂解過程中產(chǎn)生的碳正離子而使裂解產(chǎn)生的副反應最少，利于純化分離。

總之，實驗結(jié)果證明，規(guī)模的擴大并沒有影響產(chǎn)品的產(chǎn)率及純度，反而由于后處理操作樣品損失的減少提高了產(chǎn)率。本法操作簡便，經(jīng)濟有效，為比伐盧定的工藝化大量合成的研究打了下良好基礎。

［1］Lindsey JB，Cohen DJ，Stolker JM，et al.The impact of bivalirudin on percutaneous coronary intervention-related bleeding［J］.EuroIntervention，2010，6（2）：206－213.

［2］Rassen JA，Mittleman MA，Glynn RJ，et al.Safety and effectiveness of bivalirudin in routine care of patients undergoing percutaneous coronary intervention［J］.Eur Heart，2010，31（5）：561-572.

［3］Parry MA，Maraganore JM，Stone SR.Kinetic mechanism for the interaction of Hirulog with thrombin［J］.Biochemistry，1994，33（1）:14807-14814.

［4］鄭彥慧，張艷平，張浩，等.Fmoc 保護氨基酸與Wang 樹脂的縮合反應［J］.高等學?；瘜W學報，2008，29（9）:1769-1772.

［5］王德心.固相有機合成－原理及應用指南［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2004：P96-97.

［6］王德心，孫穎.裂解肽-Wang樹脂的新試劑［J］.化學試劑，1995，17（2）:101-103.