周國(guó)雄 張淼 丁曉凌 張海峰 曹維 瞿利帥 蒯小玲 張弘 徐正府

·論著·

半乳凝素3在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖和侵襲的影響

周國(guó)雄 張淼 丁曉凌 張海峰 曹維 瞿利帥 蒯小玲 張弘 徐正府

目的研究半乳凝素3(galectin-3)在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖和侵襲能力的影響。方法采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和RT-PCR方法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC1、AsPC-1的galectin-3蛋白和mRNA表達(dá)。分別應(yīng)用1、2、3、5 μg/ml galectin-3單抗處理SW1990細(xì)胞24、48、72 h，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果胰腺癌SW1990、PANC1、AsPC-1細(xì)胞均有g(shù)alectin-3 mRNA和蛋白表達(dá)。galectin-3單抗呈濃度和時(shí)間依賴性抑制SW1990細(xì)胞的增殖及穿膜細(xì)胞數(shù)。培養(yǎng)72 h時(shí)2、3、5 μg/ml galectin-3單抗的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為19.8%、29.9%和42.7%，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。3 μg/ml galectin-3單抗組的穿膜細(xì)胞抑制率為37.1%，與對(duì)照組的10.4%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論galectin-3在胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，用抗體中和galectin-3能抑制SW1990細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

胰腺腫瘤； 半乳糖凝集素3； 細(xì)胞增殖； 腫瘤浸潤(rùn)

半乳凝素(galectin)是動(dòng)物凝集素家族中的一員，有多種生物學(xué)功能。到目前為止，已識(shí)別的哺乳動(dòng)物半乳凝素家族有15個(gè)成員。Galectin-3是其中之一，它廣泛表達(dá)于正常組織和腫瘤組織中，參與多種生理和病理過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、細(xì)胞黏附及新生血管形成和腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等[1]。目前關(guān)于galectin-3在胰腺癌中作用的研究報(bào)道比較少。本研究檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株galectin-3的表達(dá)，觀察其在細(xì)胞增殖、侵襲中的作用。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC1、AsPC-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至80%左右時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3比例傳代接種至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

二、Galectin-3蛋白檢測(cè)

采用常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)方法。鼠抗人galectin-3單克隆抗體(美國(guó)R&D公司)工作濃度1∶100，用TBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

三、Galectin-3 mRNA檢測(cè)

采用RT-PCR方法。應(yīng)用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取胰腺組織總RNA，根據(jù)Genbank中基因序列自行設(shè)計(jì)引物，由invitrogen(上海)公司合成。galectin-3引物序列為5′-GGCCACTGATTGTGCCTTAT-3′和5′-CAAATGGGAAAACCGACTGT-3′，產(chǎn)物243 bp；內(nèi)參β-actin引物序列為5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′和5′-ATGCATTCACCTCCCCTGTG-3′，產(chǎn)物486 bp。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃ 3 min，94℃ 30 s、55℃ 40 s、72℃ 40 s，30次循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后用圖像掃描儀測(cè)定光吸收值，以目的條帶與β-actin條帶的光吸收值比為mRNA相對(duì)表達(dá)量。

四、細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用CCK-8法。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌SW1990細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104ml,接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。待細(xì)胞貼壁后分為對(duì)照組，galectin-3單抗1、2、3、5 μg/ml組及空白組，各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)液均無(wú)血清。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。用空白組調(diào)零，酶標(biāo)儀測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)各孔A450值。增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A450值/對(duì)照組A450值)×100%。

五、 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

在冰上將Matrigel膠與無(wú)血清的4℃預(yù)冷細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM按1∶8稀釋，加入transwell上室，每室100 μl。37℃孵育5 h后用無(wú)血清培養(yǎng)基輕洗上室凝膠，再37℃孵育30 min。用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×105/ml 。上室加200 μl含0(對(duì)照)、1、2、3 μg/ml galectin-3抗體的細(xì)胞懸液，下室加600 μl含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每組3個(gè)小室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，計(jì)算各小室的穿膜細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲抑制率 =[(對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)-加抗體組穿膜細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)]×100%。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、SW1990、PANC1、AsPC-1細(xì)胞的galectin-3蛋白及mRNA表達(dá)

胰腺癌SW1990、PANC1、AsPC-1細(xì)胞均有g(shù)alectin-3蛋白及mRNA表達(dá)(圖1、2)。

圖1SW1990(a)、PANC1(b)、AsPC-1(c)細(xì)胞的galectin-3蛋白表達(dá)(×200)

1、4：SW1990；2、5：PANC1；3、6：AsPC-1

二、Galectin-3單抗對(duì)SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同濃度galectin-3單抗處理后，SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)呈濃度和時(shí)間依賴性被抑制(表1)。培養(yǎng)24 h時(shí)2 μg/ml galectin單抗的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為27.0%；培養(yǎng)48 h時(shí)3、5 μg/ml galectin單抗的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為22.0%和35.1%；培養(yǎng)72 h時(shí)2、3、5 μg/ml galectin單抗的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為19.8%、29.9%和42.7%，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

三、Galectin-3對(duì)SW1990細(xì)胞侵襲能力的影響

Galectin-3單抗呈濃度依賴性抑制穿膜細(xì)胞數(shù)(圖3)，1、2、3 μg/ml galectin-3單抗的抑制率分別為10.4%、11.6%、37.1%。

組別24h48h72h對(duì)照組0.403±0.0140.502±0.0050.600±0.0031μg/ml組0.383±0.0160.488±0.0140.582±0.0192μg/ml組0.371±0.0270.476±0.0170.561±0.009a3μg/ml組0.362±0.0400.469±0.028a0.544±0.006a5μg/ml組0.348±0.015a0.449±0.006a0.515±0.009a

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

圖3對(duì)照組(a)及1(b)、2(c)、3(d)μg/ml galectin-3單抗組的穿膜細(xì)胞(×100)

討 論

Galectin-3在多數(shù)腫瘤中呈高表達(dá)，發(fā)揮著多種生物學(xué)作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、細(xì)胞黏附、參與新生血管形成及腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等。Kawachi等[2]研究發(fā)現(xiàn),在甲狀腺癌組織中g(shù)alectin-3呈高表達(dá)，且晚期甲狀腺癌的表達(dá)量更高，而甲狀腺正常組織、癌旁組織及甲狀腺腺瘤中g(shù)alectin-3無(wú)表達(dá)或極弱表達(dá)。然而Idikio[3]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織galectin-3的表達(dá)較正常乳腺組織下調(diào)，表明galectin-3在不同腫瘤中的表達(dá)是不一樣的。本研究證實(shí)，胰腺癌SW1990、PANC1、AsPC-1細(xì)胞均有g(shù)alectin-3 mRNA和蛋白表達(dá)，提示galectin-3可能在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

Lin等[4]在乳腺癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，galectin-3下調(diào)cyclin E和cyclin A表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞周期抑制蛋白p21和p27的表達(dá)，同時(shí)還活化細(xì)胞周期D1啟動(dòng)子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究表明，galectin-3通過(guò)結(jié)合胞內(nèi)β-連環(huán)蛋白(catenin)，活化cyclin D1而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[5]。另有研究小組觀察到轉(zhuǎn)染了編碼galectin-3的cDNA的腫瘤細(xì)胞在促凋亡因子的作用下，使galectin-3從胞質(zhì)或胞核中移位到線粒體膜上，穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制細(xì)胞色素C的釋放，保護(hù)線粒體免受損傷，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， galectin-3單抗呈濃度和時(shí)間依賴性抑制SW1990細(xì)胞的增殖，驗(yàn)證了galectin-3對(duì)胰腺癌細(xì)胞株SW1990的促增殖作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，galectin-3單抗呈濃度依賴性抑制胰腺癌SW1990的侵襲能力，提示galectin-3促進(jìn)細(xì)胞的侵襲。其機(jī)制主要是：(1)上調(diào)整合素的表達(dá)量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的黏附[7]， 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲；(2)直接與整合素 β亞基 以凝集素-糖化合物相結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的黏附[8]；(3)與細(xì)胞表面CD98結(jié)合后促使整合素在細(xì)胞表面聚集成簇，間接增強(qiáng)整合素與其配體的親和力，增加腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附；(4)直接結(jié)合糖基化的細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括成黏連蛋白、纖維蛋白、黏蛋白和Mac-2 結(jié)合蛋白等。

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Expressionofgalectin3anditseffectsonproliferationandinvasioninpancreaticcancerSW1990cells

ZHOUGuo-xiong,ZHANGMiao,DINGXiao-ling,ZHANGHai-feng,CAOWei,JULi-shuai,KUAIXiao-ling,ZHANGHong,XUZheng-Fu.

DepartmentofGastroeterology,AffiliatedHospital,NantongUniversity,Nantong226001,ChinaCorrespondingauthor：ZHOUGuo-xiong,Email：zhouguoxiong@medmail．com．cn

ObjectiveTo investigate the expression of galectin-3 in pancreatic cancer cell and its effect on the proliferation and invasion of SW1990.MethodsImmunocytochemistry and semi-quantitative RT-PCR was used to detect the expression of galectin-3 protein and mRNA in SW1990, PANC1 and ASPC-1 cell lines. Galectin-3 mono-antibody of different concentrations (1, 2, 3, 5 μg/ml) was used to treat SW1990 cells for 24, 48, 72 h, CCK-8 kits were used to detect the proliferation in SW1990 cells; Transwell chamber was used to study the invasion in SW1990.ResultsExpression of galectin-3 protein and mRNA was present in SW1990, PANC1, and ASPC-1. Galectin 3 mono-antibody inhibited the proliferation and number of invasive cells in a dose and time dependant manner. The inhibitory rates at 72 h were 19.8%, 29.9% and 42.7% in 2, 3, 5 μg/ml galectin 3 mono-antibody groups, the difference among them and control group was statistically significant (P<0.05). The inhibite rate of permeating membrane cells in 3 μg/ml galectin-3 mono antibody was 37.1%, the difference between this group and control group was statistically significant (P<0.05).ConclusionsGalectin-3 is highly expressed in pancreatic cancer cells. Galectin-3 antibody can inhibit the proliferation and migration capability of SW1990 cells.

Pancreatic neoplasms; Galectin-3; Cell proliferation; Neoplasm invasiveness

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.009

江蘇省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目(LJ201135)

226001 南通，南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化科

周國(guó)雄，Email：zhouguoxiong@medmail．com．cn

2012-08-23)

(本文編輯：呂芳萍)