趙嚴(yán) 賈蓉蓉 胡國(guó)勇 王興鵬 邱云平 蘇明明 賈偉

高脂血癥性胰腺炎患者代謝組學(xué)研究

趙嚴(yán) 賈蓉蓉 胡國(guó)勇 王興鵬 邱云平 蘇明明 賈偉

核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance, NMR)、氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(gas chromatography time-of-flight mass spectrometry, GC-TOF MS)等是當(dāng)前代謝組學(xué)的主要分析手段。與核磁共振波譜相比，GC-TOF MS法兼具色譜的高分離效率和質(zhì)譜的高分辨率，且擁有較完備的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)用于代謝物鑒定,因而在代謝輪廓分析中日益受到重視。在我國(guó)，由于飲食結(jié)構(gòu)的改變，高脂血癥性(主要是高三酰甘油)胰腺炎(hyperlipidemic pancreatitis，HLP)已經(jīng)成為急性胰腺炎(AP)的常見(jiàn)病因之一[1]。本研究采用GC-TOF MS分析正常人、HLP患者血清代謝組特性，利用正交偏最小方差判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,辨識(shí)各組間代謝物質(zhì)的差異。

一、材料與方法

1．研究對(duì)象：收集2006年10月至2009年3月山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的24例HLP患者。選擇與患者年齡、性別等相匹配的39例健康者作為對(duì)照。HLP診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)胰腺病學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)[2]：(1)具有AP臨床表現(xiàn)；(2)入院時(shí)(治療前)血三酰甘油(TG)≥11.3 mmol/L，或TG5.6～11.3 mmol/L且血清呈脂濁；(3)排除膽道疾患、酗酒、藥物、腫瘤、外傷等病因。

2．方法：入院24 h內(nèi)采取血液標(biāo)本，檢測(cè)血常規(guī)、血脂、電解質(zhì)、腎功能、血?dú)夥治?、血糖、血鈣、肝功能、CRP等指標(biāo)。同時(shí)留取一份血液，分離血清，置-80℃保存，待GC-TOF MS分析。

患者以及健康者均簽署知情同意書(shū)，詳細(xì)說(shuō)明本研究的目的和方法。在樣本收集前一天要求食用清淡飲食，避免海鮮以及辛辣食物，并禁止采樣前一天喝酒與吸煙，以減少食物對(duì)代謝造成的波動(dòng)。

3．GC-TOF MS：100 μl血清分別加入內(nèi)標(biāo)氯苯丙氨酸水溶液(0.3 mg/ml)和十七烷酸(1 mg/ml)溶液各10 μl,用甲醇∶氯仿(3∶1)300 μl提取代謝物，取上清300 μl真空濃縮干燥。干燥后用15 mg/ml吡啶溶劑的甲氧胺80 μl和80 μl N-O-雙(三甲硅基)氟乙酰胺[Bis(trimethylsilyl) trifluoroace-tamide, BSTFA)，含1% TMC]進(jìn)行兩步反應(yīng)，室溫下放置1 h后進(jìn)樣分析。

氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀為美國(guó)Leco公司(Pegasus HT)產(chǎn)品，DB-5 ms氣相毛細(xì)管色譜柱購(gòu)自安捷倫科技有限公司。MS分析條件：氣相升溫程序?yàn)?0℃初溫2 min，以10℃/min的速率升至180℃，再以5℃/min的速率升至240℃，以25℃/min速率升至290℃，保留9 min。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用Matlab軟件進(jìn)行譜峰的判別和提取，將保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度組成三維矩陣表，導(dǎo)入到SIMCA軟件進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析。多維統(tǒng)計(jì)分析得到的差異變量通過(guò)商品化NIST化合物庫(kù)進(jìn)行檢索，尋找匹配度、質(zhì)譜圖等參考化合物。利用已建立好的標(biāo)品庫(kù)對(duì)參考化合物進(jìn)行驗(yàn)證，從而確定所尋找的差異代謝物[3]。

二、結(jié)果

1．HLP患者血清的OPLS-DA分析：HLP患者血清的OPLS-DA模型區(qū)與健康者的OPLS-DA模型區(qū)能完全區(qū)分開(kāi)(圖1)。

圖1 健康者(▼)及HLP患者(▲)的血清OPLS-DA圖

2．HLP患者與健康者血清代謝物質(zhì)的差異： HLP患者與健康者血清的差異性代謝物質(zhì)有4種，其中參與氨基酸代謝的丙氨酸(Alanine)、參與能量代謝的檸檬酸(Citrate)及延胡索酸(Fumaric acid)水平下降，參與脂肪酸代謝的十八烷酸(Octadecanoic acid)水平升高。

討論GC-TOF MS以其分辨率高、響應(yīng)快、適于痕量分析等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于食品安全、農(nóng)藥殘留、藥物濫用和人體新陳代謝物質(zhì)等分析領(lǐng)域。我們前期的代謝組學(xué)研究顯示，HLP患者和健康者尿樣的代謝圖譜完全不同[3]。尿樣有取樣方便，對(duì)人體完全無(wú)創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)，但易受到飲食、飲水量以及腎臟功能等方面影響。為了更全面而又更加穩(wěn)定地獲取HLP相關(guān)代謝通路的變化，本研究檢測(cè)血清代謝組學(xué)，并與尿樣中得到結(jié)果進(jìn)行相互驗(yàn)證和補(bǔ)充。

本研究結(jié)果顯示，HLP患者血清丙氨酸、檸檬酸、延胡索酸等代謝物水平顯著低于健康者，而十八烷酸顯著高于健康者，與前期尿液中差異代謝物的結(jié)果一致[3]。Bohus等[4]亦報(bào)道，以L-精氨酸誘導(dǎo)SD大鼠胰腺炎模型后，與三羧酸循環(huán)相關(guān)的中間代謝產(chǎn)物如：檸檬酸、a-同戊二酸、琥珀酸、延胡索酸等水平下降。檸檬酸和延胡索酸作為三羧酸循環(huán)中的主要中間代謝物質(zhì)，它們的下降可能預(yù)示著HLP患者能量代謝中有氧呼吸的下調(diào),表明有氧呼吸能量代謝的降低與HLP的關(guān)系密切。三羧酸循環(huán)發(fā)生于細(xì)胞的線粒體中，因此三羧酸循環(huán)底物的改變與機(jī)體的線粒體功能改變相關(guān)。王艷蕾等[5]在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠模型證實(shí)，胰腺細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶活性下降。因此維持線粒體功能，減輕胰腺亞細(xì)胞器功能的損害，可以改善HLP患者的預(yù)后。

三酰甘油的代謝產(chǎn)物游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)可引起或加重AP病情。本研究發(fā)現(xiàn)，HLP患者血清中多種飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸，如十八烷酸、二十烷酸、棕櫚酸等水平升高。楊佳芳等[6]曾報(bào)道，高三酰甘油血癥能引起ANP大鼠與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因，如脂肪酸易位酶、脂肪酸結(jié)合蛋白、脂質(zhì)代謝酶等表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常。但這些代謝物的生化意義還有待于進(jìn)一步研究。

[1] 黃開(kāi)紅,林萍,聶勝利,等.廣東地區(qū)1316例急性胰腺炎的臨床流行病學(xué)特征.中華內(nèi)科雜志,2007,46:831-834.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)胰腺病學(xué)組.中國(guó)急性胰腺炎診治指南.中華消化雜志,2004,24:190-192.

[3] 趙嚴(yán),吳建兵,潘立,等.高脂血癥性胰腺炎患者尿樣的代謝組學(xué).中華胰腺病雜志,2009,9:85-88.

[4] Bohus E,Coen M,Keun HC,et al.Temporal metabonomic modeling of L-arginine-induced exocrine pancreatitis.J Proteome Res,2008,7:4435-4445.

[5] 王艷蕾,賈玉杰,姜妙娜,等.梔子對(duì)重癥急性胰腺炎胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響及其與內(nèi)毒素氧自由基的關(guān)系.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2007,36:22-24.

[6] 楊佳芳,王興鵬,吳愷.高脂血癥引起急性胰腺炎大鼠基因表達(dá)變化.中華消化雜志，2007,5:322-325.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.016

國(guó)家自然科學(xué)基金(30971359)；國(guó)家863計(jì)劃(2009AA02Z116)

200072 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院 上海市第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科(趙嚴(yán)、賈蓉蓉、胡國(guó)勇、王興鵬)；上海交通大學(xué)藥學(xué)院(邱云平、蘇明明、賈偉)

王興鵬，Email:wangxp1965@yahoo.com.cn

2012-02-14)

(本文編輯：屠振興)