盛閩 王鋒 黃鶴光 陳志耀

·論著·

E-選擇素在大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷組織的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其意義

盛閩 王鋒 黃鶴光 陳志耀

目的探討E-選擇素在實(shí)驗(yàn)性急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織的表達(dá)及其意義。方法按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為對(duì)照組及ANP組。采用逆行膽胰管注射5%?；悄懰徕c制作大鼠ANP模型，術(shù)后3、6、12、24 h分批處死動(dòng)物。檢測(cè)血清淀粉酶、白蛋白及Ca2+水平，計(jì)算肺濕/干重比，常規(guī)行胰腺和肺組織病理檢查并評(píng)分，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組化法檢測(cè)大鼠肺組織E-選擇素mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果ANP 6 h組大鼠血淀粉酶、胰腺及肺病理評(píng)分、肺濕/干重比分別為(3978±476)U/L、(8.22±0.63)分、(12.31±1.58)分、5.21±0.20，均顯著高于對(duì)照組的(843±90)U/L、(0.22±0.36)分、(0.13±0.34)分、4.46±0.17(P<0.05或<0.01)；血清白蛋白水平為(12.9±1.0)g/L，顯著低于對(duì)照組的(15.6±0.7)g/L(P<0.01)；12 h時(shí)的血Ca2+水平為(2.33±0.15)mmoL/L，顯著低于對(duì)照組的(2.57±0.23)mmoL/L(P<0.01)。E-選擇素定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)。ANP 6 h組大鼠肺組織E-選擇素mRNA與蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(3.51±0.45比0.95±0.16；0.174±0.019比0.060±0.006，P值均<0.01)。結(jié)論ANP大鼠并發(fā)肺損傷時(shí)肺組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào)，并參與白細(xì)胞的附壁及外滲，促進(jìn)肺損傷。

胰腺炎，急性壞死性； 肺損傷； E-選擇素； 模型，動(dòng)物

重癥急性胰腺炎(SAP)早期易誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，進(jìn)而發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。E-選擇素是內(nèi)皮細(xì)胞特有的選擇素，是誘導(dǎo)性黏附分子[1]，幾乎僅表達(dá)在活化的內(nèi)皮細(xì)胞上，在肺臟尤為明顯。正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞僅少量表達(dá)E-選擇素，在TNF-α、IL-1β及脂多糖等刺激后表達(dá)顯著增加。本研究檢測(cè)急性壞死性胰腺炎(ANP)并發(fā)ALI大鼠E-選擇素的表達(dá)，評(píng)估E-選擇素在ANP肺損傷中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠64只，體重200～250 g，由上海斯萊克動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合2006年科技部關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的規(guī)定[2]。

按照隨機(jī)數(shù)字法將SD大鼠分為對(duì)照組和ANP組，每組32只。采用膽胰管逆行注射5%脫氧?；悄懰徕c溶液1 ml/kg體重的方法制備ANP模型，對(duì)照組僅將胰腺翻動(dòng)按摩后即關(guān)腹。術(shù)后3、6、12、24 h分批處死大鼠。心尖采血，離心分離血清。用預(yù)冷PBS由心尖入路快速灌注沖洗，去除肺組織血管床中殘留血液，切取右下肺置-80°C冰箱保存，取右上肺及部分胰腺，甲醛固定，取左肺測(cè)濕、干重。

二、方法

1．血清淀粉酶、白蛋白及Ca2+水平檢測(cè)：采用全自動(dòng)生化分析儀(LX20，Beckman)測(cè)定。

2．肺濕/干重比(W/D)：吸干左肺表面水分，稱濕重，然后將標(biāo)本置于70℃烤箱烤72 h至恒重，稱干重，計(jì)算W/D。

3．胰腺及肺組織病理學(xué)檢查：常規(guī)行病理學(xué)檢查，并參照Schmidt等[3]標(biāo)準(zhǔn)和Thome等[4]標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)胰腺及肺損傷評(píng)分。

4．E-選擇素檢測(cè)：采用免疫組化法檢測(cè)E-選擇素的表達(dá)，試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司，按說明書操作。兔抗大鼠E-選擇素多抗(美國(guó)abCAM)工作濃度1∶100，生物素化羊抗兔IgG工作濃度1∶1000。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。在400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，用image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)行圖像掃描，以平均光密度值表示蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

5．肺組織E-選擇素mRNA 檢測(cè)：按50～100 mg組織加入1 ml Trizol提取RNA。采用熒光定量PCR法檢測(cè)E-選擇素mRNA 表達(dá)。E-選擇素引物上游5′-CTGCGATGCTGCCTACTTG-3′，下游5′-CCTGATTGCTCGCATCTTAGA-3′，產(chǎn)物231 bp；內(nèi)參GAPDH引物上游5′-AAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′，下游5′-CCAGTAGACTCCACGACATACTCA-3′，產(chǎn)物137 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：30℃ 10 min，42℃ 60 min，75℃ 15 min；PCR反應(yīng)： 95℃ 2 min，95℃ 10 s、60℃ 40 s，45次循環(huán)。通過PCR儀自帶軟件獲取△Ct值。mRNA表達(dá)量以2-△△Ct計(jì)算。以對(duì)照組為1，計(jì)算ANP組的表達(dá)倍數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、大鼠一般情況及胰腺、肺大體病理改變

ANP組大鼠術(shù)后逐漸出現(xiàn)氣促加劇、煩躁不安或靜默不動(dòng)、厭食、呼吸困難等表現(xiàn)，瀕臨死亡前體溫下降，口鼻有淡紅色異常分泌物。處死后見腹腔內(nèi)有渾濁血性腹水，胰腺充血水腫、出現(xiàn)黃色膠凍樣凝固壞死和皂化斑形成；大網(wǎng)膜、腸系膜等處廣泛粘連，腸管淤腫、擴(kuò)張；肝臟表面見散在出血灶及黃白色壞死灶；肺臟表面有不同程度充血水腫，呈點(diǎn)狀至片狀出血斑，伴發(fā)3.5～5.5 ml胸水，24 h呈彌漫性出血(圖1)。對(duì)照組大鼠無明顯異常。

二、胰腺、肺組織病理改變

對(duì)照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)基本完整清晰，腺泡細(xì)胞排列有序。ANP組大鼠胰腺水腫出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺細(xì)胞壞死，腺體結(jié)構(gòu)消失，腺葉間隙增寬(圖1)。對(duì)照組大鼠肺組織未見明顯病理變化，ANP組大鼠3 h時(shí)見肺內(nèi)毛細(xì)血管充血，間質(zhì)水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞滲出；6 h時(shí)病變加重，肺泡腔內(nèi)見少量淡紅色滲液，白細(xì)胞附著內(nèi)皮細(xì)胞表面，內(nèi)皮細(xì)胞部分水腫；12 h時(shí)肺泡腔內(nèi)滲液、出血擴(kuò)大，肺泡間隔明顯增寬，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，部分肺泡萎陷不張，部分肺泡代償擴(kuò)張；24 h時(shí)肺組織內(nèi)彌漫出血，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁破裂，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺組織出現(xiàn)實(shí)變(圖2)。胰腺及肺組織病理評(píng)分見表1。

圖1ANP組24 h肺大體改變(a)和胰腺組織病理改變(b HE ×200)

圖2對(duì)照組(a)及ANP組6(b)、24 h(c)組肺組織病理改變(HE ×200)

三、血清淀粉酶、白蛋白、Ca2+水平及肺W/D變化

ANP組血清淀粉酶呈階梯狀上升，于12 h達(dá)峰值，明顯高于對(duì)照組水平(P<0.01)；血清白蛋白在6 h后較對(duì)照組明顯下降(P<0.01)；Ca2+水平在12 h后明顯下降(P<0.05)；肺W/D比在6 h后顯著升高(P<0.01，表1)。

四、肺組織E-選擇素 mRNA及蛋白表達(dá)的變化

對(duì)照組大鼠肺組織E-選擇素 mRNA少量表達(dá)，ANP組E-選擇素mRNA表達(dá)在3 h即明顯升高，6 h達(dá)峰值，以后逐漸下降，但均高于對(duì)照組(P值均<0.01)。對(duì)照組肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞僅見少量E-選擇素蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，ANP組大鼠肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)E-選擇素，以6、12 h表達(dá)最強(qiáng)，顯著高于對(duì)照組水平(P值均<0.01，表1，圖3)。

圖3對(duì)照組(a)及ANP6(b)、24 h(c)組E-選擇素表達(dá)(免疫組化 ×400)

討 論

E-選擇素表達(dá)于炎癥部位的內(nèi)皮細(xì)胞，它的胞膜外區(qū)由1個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域、1個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣(EGF)結(jié)構(gòu)域和6個(gè)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白樣結(jié)構(gòu)域(CCP)組成，通過其C型凝集素結(jié)構(gòu)域同白細(xì)胞糖脂和糖蛋白上的唾液酸化路易糖(sLe)、唾液酸化的Lewis以及相關(guān)的巖藻糖基化的N-乙酰乳糖胺結(jié)合。E-選擇素主要介導(dǎo)白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面最初的附壁和滾動(dòng)，以及隨后遷移到炎癥組織。外滲到損傷組織中的白細(xì)胞被激活后釋放炎癥因子、氧自由基及破壞性的酶類物質(zhì)等，損傷肺組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致ALI發(fā)生、發(fā)展[5-6]。一些有害的炎癥因子也可以通過E-選擇素介導(dǎo)進(jìn)入到損傷組織中[7]，擴(kuò)大損傷效應(yīng)。Joucher等[8]報(bào)道，在離體小鼠肺細(xì)胞凋亡模型中，E-選擇素的高表達(dá)是細(xì)胞凋亡的重要條件，且與FasL有關(guān)，還與蛋白酪氨酸磷酸酶活性增高有關(guān)。Hidalgo等[9]報(bào)道，E-選擇素可使極化、激活的整合素αMβ2聚集在滾動(dòng)的中性粒細(xì)胞前沿，進(jìn)而捕獲血小板和紅細(xì)胞，導(dǎo)致急性血管閉塞，連同產(chǎn)生的氧化物引起血管損傷和肺組織急性損傷。

表1 各組大鼠檢測(cè)指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，aP<0.05，bP<0.01

本研究結(jié)果顯示，ANP大鼠肺組織E-選擇素mRNA及蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，肺組織小血管內(nèi)皮早期出現(xiàn)白細(xì)胞的邊集、滲出，以及在肺泡或肺間質(zhì)中聚集，進(jìn)一步證實(shí)E-選擇素是白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞形成接觸的啟動(dòng)因子，是誘導(dǎo)和擴(kuò)大炎癥損傷的重要“角色”。因此，抑制E-選擇素表達(dá)對(duì)控制ANP及相關(guān)肺損傷發(fā)展具有重要作用。

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DynamicexpressionandsignificanceofE-selectininratofacutenecrotizingpancreatitisinducedlunginjury

SHENGMin,WANGFeng,HUANGHe-guang,CHENZhi-yao.

DerpatmentofSurgery,UnionHospital,FujianmedicalUniversity,Fuzhou350000,China

HUANGHe-guang,Email：hhuang2@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression and significance of E-selectin in lung tissue of rat of acute necrotizing pancreatitis (ANP)-induced lung injury.MethodsRats were randomly divided into control and ANP groups. ANP model was induced by retrograde injection of sodium taurocholate into the biliary and pancreatic duct. The rats were sacrificed at 3, 6, 12 and 24 h. Serum amylase, albumin, Ca2+and lung wet/dry (W/D) weight ratio were determined, and pancreas and lung tissues underwent routine pathological examination and histopathological scores were evaluated. The expression of E-selectin mRNA and protein in lung tissue of rat was measured by real-time fluorescence quantitative RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsIn ANP group at 6h, the serum level of amylase, histopathological scores of pancreas and lung tissues, lung W/D weight ratio were (3978±476)U/L, 8.22±0.63,(12.31±1.58, 5.21±0.20, which were significantly higher than those in control group [(843±90)U/L, 0.22±0.36,0.13±0.34,4.46±0.17，P<0.05 or <0.01], the serum level of albumin was (12.9±1.0)g/L, which was significantly lower than that in control group [(15.6±0.7)g/L,P<0.01], the serum level of Ca2+at 12 h was (2.33±0.15)mmoL/L, which was significantly lower than that in control group [(2.57±0.23)mmoL/L,P<0.01]. E-selectin was located in the cell membrane and cytoplasm of vascular endothelial cells. Expression of E-selectin mRNA and protein in the lung tissue at 6h was significantly higher than those in control group (3.51±0.45vs0.95±0.16, 0.174±0.019vs0.060±.006,P<0.01).ConclusionsPulmonary expression of E-selectin of vascular endothelial cell is significantly up-regulated in a time dependant manner when ANP-induced ALI occurs; and it is involved in leukocyte mural and extravasation, and can promote lung injury.

Pancreatitis,acute necrotizing； Lung injury； E-selectin； Models,animal

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.012

國(guó)家自然科學(xué)基金(81070369)

350000 福建福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院基本外科

黃鶴光，Email：hhuang2@yahoo.com.cn

2011-11-30)

(本文編輯：屠振興)