徐岷 姚志新 朱立寧 徐萍 周志華 龔燕芳 滿曉華 吳鶯 張尤歷

·論著·

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b在人胰腺癌組織中的表達(dá)及其意義

徐岷 姚志新 朱立寧 徐萍 周志華 龔燕芳 滿曉華 吳鶯 張尤歷

目的檢測(cè)人胰腺癌組織中DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3b(DNMT3b)的表達(dá)，分析其與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性。方法應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)12例配對(duì)人胰腺癌和癌旁組織中DNMT3b的表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)59例胰腺癌組織中DNMT3b的表達(dá)，并分析其與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，胰腺癌及癌旁組織DNMT3b蛋白表達(dá)量分別為0.69±0.13和0.14±0.03，癌組織的表達(dá)量明顯高于癌旁組織(t=4.464，P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，胰腺癌組織DNMT3b陽性高表達(dá)率為59%，癌旁組織陰性表達(dá)。腫瘤組織DNMT3b表達(dá)強(qiáng)度與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。結(jié)論DNMT3b在胰腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的惡性生物行為有關(guān)。

胰腺腫瘤； 甲基化； DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b

表觀遺傳異常是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一，它常通過DNA的甲基化、RNA表達(dá)沉默和組蛋白修飾3種方式調(diào)控基因的表達(dá)。DNA的甲基化需要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methltransferases, DNMTs)的催化，DNMT活性增高是腫瘤細(xì)胞一個(gè)具有特征性的早期分子改變，它在人類腫瘤細(xì)胞中普遍呈高表達(dá)狀態(tài)，并導(dǎo)致眾多抑癌基因CpG島異常高甲基化[1]。DNMT3b是在細(xì)胞內(nèi)建立新的DNA甲基化類型所必需[2]。本研究檢測(cè)胰腺癌和癌旁組織中DNMT3b的表達(dá)，分析DNMT3b表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性，了解其在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料與方法

一、組織標(biāo)本

收集上海長(zhǎng)海醫(yī)院2008年5月至2011年2月手術(shù)切除的新鮮胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織12例。其中男性7例，女性5例，年齡46～81歲，平均(63±10)歲；中分化腺鱗癌2例，中分化導(dǎo)管腺癌9例，低分化導(dǎo)管腺癌1例。另收集2007年12月至2011年5月胰腺癌石蠟包埋組織標(biāo)本47例，其中男性30例，女性17例，年齡31～78歲，平均(60±10)歲；中分化導(dǎo)管腺癌41例，低分化導(dǎo)管腺癌1例，中分化腺鱗癌1例，中分化黏液腺癌4例。所有患者術(shù)前均未接受放療及化療。

二、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)DNMT3b表達(dá)

取新鮮胰腺癌及癌旁組織，應(yīng)用蛋白提取試劑盒(BestBio公司)提取蛋白并定量。常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)DNMT3b表達(dá)。鼠抗人DNMT3b單克隆抗體(Abcam公司)工作濃度1∶250，鼠抗人β-actin單克隆抗體(Santa cruz公司)工作濃度1∶2000，與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育后ECL顯影，用SAGECREATION分析軟件成像及分析條帶灰度，以目的條帶與內(nèi)參β-actin的灰度比值表示蛋白的表達(dá)水平。

三、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DNMT3b表達(dá)

采用UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒(Maixin-bio公司)常規(guī)行免疫組化染色，按說明書操作?？笵NMT3b一抗工作濃度1∶500。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。由病理科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立閱片，并以雙盲法評(píng)分。DNMT3b定位于細(xì)胞核，陽性染色為棕黃色。根據(jù)核染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分：無染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分；無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞<10%為1分，10%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。兩評(píng)分相乘，0～6分為低表達(dá)，8～12分為高表達(dá)[3]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌和癌旁組織DNMT3b蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，胰腺癌及癌旁組織DNMT3b蛋白表達(dá)量分別為0.69±0.13和0.14±0.03(圖1)，癌組織的表達(dá)量明顯高于癌旁組織(t=4.464，P<0.05)。

圖1 胰腺癌組織(T)及癌旁組織(N)中DNMT3b表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，59例胰腺癌組織DNMT3b陽性高表達(dá)率為59%(35/59)，癌旁組織未見陽性細(xì)胞(圖2)。

圖2 胰腺癌(a)及癌旁組織(b)DNMT3b表達(dá)(免疫組化 ×400)

二、胰腺癌DNMT3b表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

胰腺癌組織DNMT3b的表達(dá)與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤部位、大小、浸潤(rùn)范圍、病理分型、分化程度均無關(guān)(表1)。

討 論

DNA甲基化的改變能夠影響與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，不但在細(xì)胞固有功能和正常細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中起著重要作用，而且也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素[4]。催化這一過程的是DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)，其中DNMT3包含兩個(gè)主要成員：DNMT3a和DNMT3b，主要參與從頭甲基化，以非甲基化的DNA為模板，催化新的甲基化位點(diǎn)形成[5]。

表1胰腺癌DNMT3b的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

臨床參數(shù)例數(shù)DNMT3b高表達(dá)低表達(dá)χ2值P值性別 男3720171.1410.285 女22157年齡(歲) ≤509632.2170.330 51～591679 ≥60342212腫瘤位置 胰頭3822160.0900.764 胰體尾21138腫瘤直徑 ≤4cm4124170.0340.853 >4cm18117侵及范圍 T1a5411.6930.639 T1b201010 T2261610 T3853病理分型 腺鱗癌3121.2490.536 黏液腺癌431 導(dǎo)管腺癌523121TNM分期 Ⅰ176119.1370.028 Ⅱ20119 Ⅲ20164 Ⅳ220分化程度 中分化5734230.0750.785 低分化211淋巴轉(zhuǎn)移 有211746.3220.012 無381820

DNMT3b在胚胎細(xì)胞中位于染色質(zhì)，在細(xì)胞成熟后散在分布，在功能上起促進(jìn)胚胎全程從頭甲基化的作用。有研究表明，DNMT3b在多種人類腫瘤中過表達(dá)[6]，在癌前病變向癌的轉(zhuǎn)變過程中也發(fā)現(xiàn)DNMTs表達(dá)增強(qiáng)[7]。DNMT3b在結(jié)腸癌中靶向許多重要的抑癌因子和轉(zhuǎn)錄因子，特別是結(jié)腸癌的HOXB13基因上游CpG島甲基化[8]。結(jié)腸癌組織HOXB13過量表達(dá)能夠上調(diào)Igf2表達(dá)和沉默癌抑制基因Sfrp2、Sfrp4和Sfrp5的轉(zhuǎn)錄[9]。DNMT3b還具有管理PRC1的功能[10]。DNMT1和DNMT3b還可以調(diào)節(jié)組蛋白修飾，通過聚集CTCFL/BORIS活化BAG-1基因和調(diào)節(jié)組蛋白啟動(dòng)子甲基化[11]。敲除DNMT1和DNMT3b可以增加CXCR4在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)，說明在腫瘤形成過程中DNMTs起著重要的作用[12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰腺癌組織DNMT3b蛋白表達(dá)顯著高于其配對(duì)的癌旁組織，DNMT3b陽性高表達(dá)率為59%，說明DNMT3b可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。通過DNMT3b表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的分析，發(fā)現(xiàn)DNMT3b表達(dá)與胰腺癌TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示其表達(dá)水平能夠反映胰腺癌的惡性行為，可能成為判斷胰腺癌預(yù)后的分子標(biāo)志物及新的治療靶點(diǎn)。

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ExpressionandroleofDNMT3binhumanpancreaticcancertissue

XUMin,YAOZhi-xin,ZHULi-nin,XUPing,ZHOUZhi-hua,GONGYan-fang,MANXiao-hua,WUYing,ZHANGYou-li.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangSuUniversity,JiangSu212001,China

ZHANGYou-li,Email:zjyouli@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of DNMT3b and its correlation with clinicopathological parameters of pancreatic cancer.MethodsThe expressions of DNMT3b protein in 12 pancreatic cancer tissues and para-cancerous tissues were detected by Western blot. The expressions of DNMT3b protein in 59 pancreatic cancer tissues were detected by immunohistochemistry. The association of DNMT3b expression and clinicopathological parameters of pancreatic carcinoma were analyzed.ResultsWestern blot results showed the expressions of DNMT3b protein in pancreatic cancer tissues and para-cancerous tissues were 0.69±0.13and0.14±0.03, and the protein level of DNMT3b in pancreatic cancer tissues were significantly higher than that in para-cancerous tissues (t=4.464,P<0.05). Immunohistochemistry examination showed that the positive rates of DNMT3b protein were 59% in pancreatic cancer tissues and negative in para-cancerous tissues. DNMT3b expression was positively correlated with the TNM stage and lymph node metastasis.ConclusionsDNMT3b is highly expressed in pancreatic cancer tissues, and it is related with malignant biological behaviors of pancreatic cancer cells.

Pancreatic neoplasms； Methylation； DNA methyltransferase 3b

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.010

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2009210)；江蘇省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(H200836)；鎮(zhèn)江市科研計(jì)劃項(xiàng)目(SH2009012)

212001 江蘇鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化科(徐岷、姚志新、朱立寧、徐萍、吳鶯、張尤歷)；解放軍第101醫(yī)院病理科(周志華)；第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化科(龔燕芳、滿曉華)

張尤歷，Email：zjyouli@yahoo.com.cn

2012-05-17)

(本文編輯：呂芳萍)