張 琦， 王 健， 陳 融， 彭 程， 牛衛(wèi)博， 牛 軍

(1山東大學第二醫(yī)院血液腫瘤生物治療研究所, 山東 濟南 250033； 2浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院腫瘤外科，浙江 杭州 310009；山東大學 3醫(yī)學院機能實驗室， 4齊魯醫(yī)院肝膽外科, 山東 濟南250012)

2012-07-19

2012-09-21

國家自然科學基金資助項目(No.30570833; No.30872460)

△通訊作者 Tel: 0531-85875635； E-mail: ydzhang@sdu.edu.cn

▲并列第1作者

整合素αvβ6對結(jié)腸癌細胞中整合素αvβ5內(nèi)吞胞吐循環(huán)的影響*

張 琦1▲， 王 健2▲， 陳 融3△， 彭 程4， 牛衛(wèi)博4， 牛 軍4

(1山東大學第二醫(yī)院血液腫瘤生物治療研究所, 山東 濟南 250033；2浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院腫瘤外科，浙江 杭州 310009；山東大學3醫(yī)學院機能實驗室，4齊魯醫(yī)院肝膽外科, 山東 濟南250012)

目的探討整合素αvβ6對結(jié)腸癌細胞中整合素αvβ5內(nèi)吞胞吐循環(huán)及細胞黏附、遷移能力的影響。方法采用Western blotting檢測不同細胞中整合素αvβ6和αvβ5的表達情況，通過整合素內(nèi)吞實驗、胞吐實驗和capture-ELISA實驗檢測不同細胞中整合素αvβ6和αvβ5的內(nèi)吞胞吐循環(huán)時相，利用細胞黏附實驗和細胞遷移實驗檢測各種細胞在不同基質(zhì)表面黏附和遷移能力的差異。結(jié)果SW480、SW480 wild-type β6和SW480 mock細胞中整合素αv亞基和β5亞基的表達無顯著差異(P>0.05)，SW480 wild-type β6細胞中整合素β6亞基的表達顯著高于另外2種細胞(P<0.05)；SW480細胞中整合素αvβ5存在內(nèi)吞胞吐循環(huán)，但當向SW480細胞中轉(zhuǎn)染β6亞基后，整合素αvβ6進行內(nèi)吞胞吐循環(huán)的同時，會對整合素αvβ5的內(nèi)吞和胞吐過程產(chǎn)生抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；3種細胞中整合素αvβ6和αvβ5的內(nèi)吞胞吐循環(huán)的差異，會影響細胞在纖連蛋白(整合素αvβ6配體)和玻連蛋白(整合素αvβ5配體)表面的黏附和遷移能力。結(jié)論整合素αvβ6和αvβ5擁有共同的α亞基，它們在細胞內(nèi)的內(nèi)吞胞吐循環(huán)存在某種競爭性關(guān)系，當二者同時存在時，整合素αvβ6會抑制αvβ5的內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程，并由此對細胞在相應基質(zhì)表面黏附和遷移能力產(chǎn)生影響。

整合素類； 結(jié)腸腫瘤； 胞吞作用； 胞吐作用； 細胞運動

整合素是一種由α、β亞單位以非共價鍵結(jié)合組成的重要細胞黏附分子，介導細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)的黏附作用[1]。目前在脊椎動物中共發(fā)現(xiàn)18種α亞單位和8種β亞單位，它們通過不同的組合可以形成24種整合素亞型[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)整合素亞型并不是靜止在細胞膜上，而是在細胞內(nèi)進行持續(xù)快速的內(nèi)吞胞吐循環(huán)，它們在細胞遷移等生物學過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[3-5]。整合素αvβ6是一種特殊的上皮細胞限制性整合素亞型，它的主要配體是纖維連接蛋白。在正常上皮組織中無法檢測到β6整合素mRNA和蛋白的表達，但是β6整合素卻可以出現(xiàn)在胚胎形成、組織損傷修復和一系列上皮源性惡性腫瘤組織中[6-11]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，αvβ6作為一種特殊的整合素亞型，可以通過不同的途徑參與上皮源性腫瘤的惡性進展過程，加速癌細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[12-17]。一般情況下，在正常上皮細胞中，整合素αv亞單位可以與β5亞基結(jié)合，形成整合素αvβ5，但當細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并處于高度增殖遷移狀態(tài)后，整合素αvβ6的表達就會明顯上調(diào)，同時伴隨整合素αvβ5的表達顯著降低[16, 18]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，整合素是否存在內(nèi)吞胞吐循環(huán)，主要決定于α亞單位的類型，實驗研究證實整合素αvβ6和αvβ5均存在內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程，它們通過網(wǎng)格蛋白(clathrin)依賴的途徑內(nèi)吞進入細胞內(nèi)，擁有共同的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運機制。既然整合素αvβ6和αvβ5均包含α亞單位，又通過相同的途徑內(nèi)吞進入細胞內(nèi)，那么它們在內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程可能就會存在一定的相互影響，本研究在此基礎上，借鑒目前較為成熟的內(nèi)吞胞吐循環(huán)檢測方法[19]，驗證結(jié)腸癌細胞中整合素αvβ6和αvβ5內(nèi)吞胞吐循環(huán)之間的相互作用關(guān)系，從而為進一步揭示整合素內(nèi)吞胞吐循環(huán)的分子機制奠定基礎。

材 料 和 方 法

1細胞株和試劑

人結(jié)腸癌SW480細胞購自ATCC，SW480 wild-type β6和SW480 mock細胞為本課題組前期構(gòu)建[15]；整合素αvβ6單克隆抗體10D5和整合素αvβ5單克隆抗體15F11購自Millipore；整合素αv亞單位單克隆抗體P2W7、整合素β6亞單位單克隆抗體C-19和整合素β5亞單位單克隆抗體E-19購自Santa Cruz；EZ-LinkTMSulfo-NHS-SS-Biotin購自Pierce；mesna、吲哚乙酸(indoleacetic acid,IAA)、纖連蛋白(fibronectin)和玻連蛋白(vitronectin)均購自Sigma-Aldrich；streptavidin-HRP購自GenScript；鄰苯二胺(o-phenylene diamine，OPD)購自Amresco；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco。

2方法

2.1細胞培養(yǎng) 人類結(jié)腸癌SW480、SW480 wild-type β6和SW480 mock細胞均用含有10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、濕度飽和的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2Western blotting實驗 收集生長狀態(tài)良好的SW480、SW480 wild-type β6和SW480 mock細胞，提取蛋白，以30 μg/well上樣，電泳(60 V、2.5 h)后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(60 V、1.5 h)，脫脂奶粉封閉2 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗常溫孵育1 h，ECL顯影，Kodak凝膠成像系統(tǒng)觀察照相并分析。

2.3整合素內(nèi)吞實驗 選取生長狀態(tài)良好的細胞，用PBS沖洗2遍，更換培養(yǎng)基，37 ℃孵育30 min；取出細胞培養(yǎng)瓶，置冰上，用冷PBS沖洗2遍，加入0.2 g/L EZ-LinkTMSulfo-NHS-SS-Biotin溶液，冰上標記60 min；用PBS溶液沖洗2遍，加入預熱的培養(yǎng)基，37 ℃孵育一定時間(5 min、15 min、30 min、60 min)后取出并立即置冰上，用冷PBS沖洗2遍；向各瓶中加入含有20 mmol/L MesNa、50 mmol/L Tris(pH 8.6)和100 mmol/L NaCl 溶液，冰上處理15 min，去除仍存在于細胞膜上的生物素；向各瓶中加入20 mmol/L IAA溶液，冰上處理10 min，以清除過量的mesna；收集細胞并裂解，BCA法測定蛋白濃度，進行Capture-ELISA實驗。

2.4整合素胞吐實驗 選取生長狀態(tài)良好的細胞，與內(nèi)吞實驗開始階段的步驟相同，用0.2 g/L EZ-LinkTMSulfo-NHS-SS-Biotin 溶液冰上標記60 min；加入預熱的培養(yǎng)基，37 ℃孵育30 min；取出細胞培養(yǎng)瓶置冰上，冷PBS沖洗2遍，各瓶中加入mesna溶液，冰上處理15 min；PBS沖洗2遍，再次加入預熱的培養(yǎng)基，37 ℃孵育，指定時間(5 min、15 min、30 min)后，取出培養(yǎng)瓶并立即置冰上，用冷PBS沖洗2遍，再次加入mesna溶液，冰上處理15 min；加入20 mmol/L IAA溶液，冰上處理10 min；收集細胞并裂解，BCA法測定蛋白濃度，進行Capture-ELISA實驗。

2.5Capture-ELISA實驗 用0.05 mol/L(pH 9.6)的碳酸鹽緩沖溶液分別配制含5 mg/L 10D5或15F11的抗體包被液，加入96孔單條可拆酶標板中，100 μL/well，4 ℃包被過夜；用0.1% Tween-20的PBS-T溶液(洗滌液)沖洗1遍，加入含0.1% Tween-20和5% BSA的PBS-T溶液室溫封閉1 h；用洗滌液沖洗1遍，拍干，上樣，確保各孔蛋白總濃度相同，4 ℃孵育過夜，進行整合素αvβ6或αvβ5的捕捉；取出酶標板，用洗滌液將酶標板沖洗5遍，向各孔中加入含streptavidin-HRP及1% BSA的PBS-T溶液100 μL/well，4 ℃孵育1 h；用洗滌液將酶標板沖洗5遍，拍干，向各孔中加入鄰苯二胺顯色液100 μL/well，常溫避光顯色10 min；然后向每孔中加入2 mol/L H2SO4溶液50 μL/well，20 min內(nèi)通過酶標儀讀取各孔492 nmA值，參考波長為630 nm。

2.6黏附實驗 向96孔板中加入10 mg/L纖連蛋白或玻連蛋白溶液50 μL/well，4 ℃孵育過夜；倒出孔中溶液，加入100 μL/well包含1%BSA的PBS，室溫封閉1 h，PBS沖洗2遍；用含0.53 mmol EDTA的PBS收集生長狀態(tài)良好的SW480 wild-type β6、SW480 Del. Mutant β6和SW480 mock細胞，吹打為單細胞懸液，細胞黏附緩沖液(包含0.2% BSA的DMEM培養(yǎng)基)沖洗2遍；細胞計數(shù)，按5×104cells/well加入96孔板中，37 ℃孵育2 h；用細胞黏附緩沖液輕微沖洗3遍，剩余黏附細胞用1%戊二醛溶液固定；用0.1%結(jié)晶紫溶液染色，1%SDS溶液處理后讀取600 nmA值。

2.7遷移實驗 將8 μm孔徑Boyden chamber小室浸泡在包含10 mg/L纖連蛋白或玻連蛋白的PBS溶液中，4 ℃孵育過夜；收集生長狀態(tài)良好的細胞，計數(shù)，用無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5×107cells/L，向24孔板Boyden chamber上室中加入2.5×104cells/well，下室中加入包含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基1 250 μL/well，置入37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育；24 h后取出，PBS淋洗，用棉簽擦去微孔膜上層細胞，將貼附于微孔膜下層的細胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色；上鏡觀察穿過膜的細胞，隨機計數(shù)5個視野，每組重復3次，取平均數(shù)計算細胞遷移率，數(shù)據(jù)處理。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1結(jié)腸癌SW480、SW480wild-typeβ6和SW480mock細胞中整合素αvβ6和αvβ5的表達

Western blotting顯示，在SW480、SW480 wild-type β6和SW480 mock細胞中，整合素αv和β5亞基的表達無顯著差異(P>0.05)；由于轉(zhuǎn)染了包含β6基因的表達載體，所以SW480 wild-type β6細胞中整合素β6亞基的表達量顯著高于SW480和SW480 mock細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Western blotting analysis of integrin αv, β6 and β5 subunit expression in SW480, SW480 wild-type β6 and SW480 mock colon cancer cells.

圖1Westernblotting檢測結(jié)腸癌SW480、SW480wild-typeβ6和SW480mock細胞中整合素αv、β6和β5亞基表達情況

2結(jié)腸癌SW480wild-typeβ6細胞中整合素αvβ6的內(nèi)吞胞吐循環(huán)

整合素內(nèi)吞實驗、胞吐實驗和capture-ELISA檢測顯示，在結(jié)腸癌SW480 wild-type β6細胞中，整合素αvβ6進行持續(xù)的內(nèi)吞胞吐循環(huán)。如圖2A所示,5 min、15 min和30 min時整合素αvβ6的內(nèi)吞比例分別為28.1%、51.9%和58.8%，60 min時的檢測結(jié)果為47.1%，低于15 min和30 min時的數(shù)據(jù)，我們考慮這主要是由于部分整合素αvβ6在60 min內(nèi)已經(jīng)完成在胞內(nèi)一周的循環(huán)，重新回到細胞膜上，被隨后加入的mesna溶液去生物素化，所以最終檢測結(jié)果偏低。如圖2B所示，5 min、15 min和30 min時整合素αvβ6的胞吐比例分別為39.5%、55.9%和68.5%。

3結(jié)腸癌SW480、SW480wild-typeβ6和SW480mock細胞中整合素αvβ5的內(nèi)吞胞吐循環(huán)

在SW480和SW480 mock細胞中，各時點整合素αvβ5的內(nèi)吞和胞吐比例無顯著差異(P>0.05)，但是在SW480 wild-type β6細胞中，由于轉(zhuǎn)染了整合素αvβ6，使整合素αvβ5的內(nèi)吞和胞吐過程均明顯減慢，組間數(shù)據(jù)比較顯著差異(P<0.05),見圖3。

圖2結(jié)腸癌SW480wild-typeβ6細胞中整合素αvβ6的內(nèi)吞胞吐循環(huán)情況

圖3結(jié)腸癌SW480、SW480wild-typeβ6和SW480mock細胞中整合素αvβ5的內(nèi)吞胞吐循環(huán)情況

4結(jié)腸癌SW480、SW480wild-typeβ6和SW480mock細胞在纖連蛋白和玻連蛋白表面黏附能力的差異

如圖4所示，SW480 wild-type β6細胞在纖連蛋白表面的黏附能力明顯強于SW480和SW480 mock細胞，差異顯著(P<0.05)，但是SW480 wild-type β6細胞在玻連蛋白表面的黏附能力明顯弱于SW480和SW480 mock細胞，差異顯著(P<0.05)。

5結(jié)腸癌SW480、SW480wild-typeβ6和SW480mock細胞在纖連蛋白和玻連蛋白表面遷移能力的差異

SW480 wild-type β6細胞在纖連蛋白表面的遷移能力明顯強于SW480和SW480 mock細胞，差異顯著(P<0.05)，但是SW480 wild-type β6細胞在玻連蛋白表面的遷移能力弱于SW480和SW480 mock細胞，差異顯著(P<0.05),見圖5。

圖4結(jié)腸癌SW480、SW480wild-typeβ6和SW480mock細胞在纖連蛋白和玻連蛋白表面的黏附能力

討 論

整合素αvβ6和αvβ5均是重要的整合素亞型，二者擁有共同的αv亞基，目前很多研究均提示它們之間存在密切的關(guān)系[16, 18]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌HT29細胞、WiDr細胞和SW480 wild-type β6細胞中，高細胞密度培養(yǎng)可以通過PKC依賴的途徑選擇性增加細胞膜上整合素αvβ6的表達，與此同時，細胞膜上整合素αvβ5和αvβ1的數(shù)量均明顯減少，整合素αvβ3的數(shù)量輕微減少或不變，但是整合素αv亞基的數(shù)量基本保持不變[16]，提示在此情況下，整合素αv亞基可以更多地與β6亞基組合形成整合素αvβ6，參與調(diào)節(jié)細胞的生物學行為。

近年來，整合素內(nèi)吞胞吐循環(huán)理論的提出為這種現(xiàn)象提供了一種更合理的解釋，Tooney等[20]提出一個模型，整合素內(nèi)吞進入胞質(zhì)后，細胞會在早期內(nèi)吞體和溶酶前體中，在分子伴侶的協(xié)助下，對各種整合素亞型進行“審查”，α和β亞基解離，根據(jù)細胞的需要重新組裝出新的整合素亞型，胞吐到細胞膜上，介導細胞與不同細胞外基質(zhì)的黏附作用。在這個模型基礎上，內(nèi)吞體就像是細胞內(nèi)各種整合素亞基的儲存庫和中轉(zhuǎn)站，細胞可以根據(jù)外部環(huán)境的變化，隨時做出快速反應，利用胞內(nèi)“儲存庫”中的整合素亞基組裝出各種整合素亞型，胞吐到細胞表面，通過調(diào)整細胞膜上整合素亞型的種類和數(shù)量，調(diào)控細胞的生物學行為。我們對在不同密度培養(yǎng)狀態(tài)下結(jié)腸癌細胞中整合素αvβ6分布狀態(tài)的研究結(jié)果也支持這一假說[21]。

圖5結(jié)腸癌SW480、SW480wild-typeβ6和SW480mock細胞在纖連蛋白和玻連蛋白表面的遷移能力

我們在本實驗中利用了前期構(gòu)建的SW480、SW480 wild-type β6和SW480 mock細胞，它們之間唯一的區(qū)別就是轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同，SW480是原始野生型細胞，SW480 wild-type β6是向SW480細胞中轉(zhuǎn)染了整合素β6亞基的細胞，SW480 mock是轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒的細胞，作為實驗的陰性對照，因此，理論上這3種細胞實驗結(jié)果的差異應該均是由于SW480 wild-type β6細胞中增加了整合素β6亞基的緣故。本實驗我們首先利用Western blotting的方法驗證了3種細胞中αv、β6和β5亞基的表達情況，并通過內(nèi)吞胞吐相關(guān)實驗方法檢測了SW480 wild-type β6細胞中整合素αvβ6的循環(huán)情況，結(jié)果提示整合素αvβ6循環(huán)狀態(tài)良好，可是，與SW480和SW480 mock細胞相比，SW480 wild-type β6細胞中整合素αvβ5的內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程明顯減慢，并且細胞在玻連蛋白表面的黏附和遷移能力也均受到抑制，提示整合素αvβ6可以競爭性抑制整合素αvβ5的內(nèi)吞胞吐循環(huán)，進而抑制整合素αvβ5介導的細胞生物學過程。

由此可見，作為細胞表面重要的黏附分子，雖然整合素αvβ6和αvβ5均可以與相應配體結(jié)合，在細胞黏附、遷移等過程中發(fā)揮重要作用，但是作為一種在正常上皮組織中不表達、而在惡性上皮性腫瘤組織中高表達的整合素亞型，整合素αvβ6具有其特殊性，當β6亞基和β5亞基同時存在時，β6亞基與αv亞基具有更強的結(jié)合能力，αv亞基可以優(yōu)先與β6亞基結(jié)合組裝形成整合素αvβ6，介導腫瘤細胞的黏附和遷移過程。另外，當整合素αvβ6和αvβ5同時存在于癌細胞中時，整合素αvβ6的內(nèi)吞胞吐循環(huán)可以正常進行，但是整合素αvβ5的內(nèi)吞胞吐循環(huán)則明顯受到了抑制，二者之間存在競爭性抑制的關(guān)系，在此情況下，整合素αvβ6功能的正常發(fā)揮更能夠促進腫瘤細胞的惡性進展。目前這2種整合素亞型之間競爭性抑制的具體調(diào)控機制仍需要進行大量系統(tǒng)、深入的研究。

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Effectsofintegrinαvβ6onendo-exocytoticcycleofintegrinαvβ5incoloncancercells

ZHANG Qi1, WANG Jian2, CHEN Rong3, PENG Cheng4, NIU Wei-bo4, NIU Jun4

(1InstituteofBiotherapyforHematologicalMalignancies,theSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China;2DepartmentofSurgicalOncology,SecondAffiliatedHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310009,China;3TeachingLaboratoryofFunctionalScience,SchoolofMedicine,4DepartmentofHepatobiliary,QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:ydzhang@sdu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of integrin αvβ6 on the endo-exocytotic cycle of integrin αvβ5 in colon cancer cells.METHODSThe expression of integrin αvβ6 and αvβ5 in SW480 cells, SW480 wild-type β6 cells and SW480 mock cells was detected by Western blotting. The trafficking of integrin αvβ6 and αvβ5 was examined by endocytosis assay, exocytosis assay and capture-ELISA. The adhesive and migration abilities of these 3 cell lines towards fibronectin or vitronectin were measured by cell adhesion assay and cell migration assay.RESULTSThe expression of integrin αv and β5 subunits was similar in these 3 cell lines (P>0.05), while the expression of integrin β6 subunit in SW480 wild-type β6 cells was much higher than that in the other 2 cell lines (P<0.05). The transfection of integrin β6 subunit into SW480 cells was able to slow down the endocytosis and exocytosis of integrin αvβ5, and subsequently inhibited the cellular adhesion and migration abilities towards vitronectin.CONCLUSIONIntegrin αvβ6 and αvβ5 share the same αv subunit. In the process of endocytosis and exocytosis, there might be some competitive relationship between these 2 integrin isoforms. Compared with integrin αvβ5, integrin αvβ6 has the priority to get into the trafficking process, and it has subsequent effects on the adhesion and migration of colon cancer cells.

Integrins; Colonic neoplasms; Endocytosis; Exocytosis; Cell movement

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.12.008