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(1 山西省農(nóng)科院材料資源研究所，太原 030031；2 山西大學生命科學與技術學院，太原 030006)

玉米種質(zhì)資源醇溶蛋白的遺傳多樣性分析

崔永霞1，張海萍1，任元1，張叢卓1，田懷東2，雷柴衛(wèi)2，張效梅1

(1 山西省農(nóng)科院材料資源研究所，太原 030031；2 山西大學生命科學與技術學院，太原 030006)

隨著分子生物學的發(fā)展，蛋白質(zhì)電泳圖譜技術已成為生物多樣性研究和材料鑒別的重要手段。本實驗對現(xiàn)有的150份特種玉米種質(zhì)資源，利用SDS-PAGE電泳技術，獲得玉米醇溶蛋白的不同電泳譜帶(γ、α1、α2、β醇溶谷蛋白組分)，主要表現(xiàn)在三個方面：(1)分子量的高低不同，電泳條帶數(shù)目不同及相對表達量不同;(2)利用等電聚焦(IEF)電泳法分析了材料間分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分，共檢測到材料內(nèi)和材料間13條不同的差異帶和特殊帶；(3)對其電泳譜帶進行聚類分析，將全部供試材料分為6大類，獲得了多樣的玉米醇溶谷蛋白資源，解析了玉米種質(zhì)資源種子醇溶谷蛋白的表型特征，揭示了其生化性狀的多樣性。

玉米；種質(zhì)資源；醇溶蛋白；電泳圖譜；聚類分析

玉米籽粒中蛋白質(zhì)含量一般在10%左右，其中80%在胚乳中，而另外20%在胚中[1]。醇溶蛋白是玉米中主要的貯藏蛋白,約占所有蛋白的45%～50%[2]。玉米醇溶蛋白具有很強的韌性、疏水性、可降解性、抗菌性等特點,廣泛用于食品、醫(yī)藥、紡織、造紙等工業(yè)[5,6]。

美國、日本都在玉米醇溶蛋白的利用上加大研究、開發(fā)力度，并從玉米淀粉渣中提取了玉米醇溶蛋白[3]。我國對玉米種子蛋白質(zhì)的研究主要集中在粗蛋白含量、總賴氨酸含量等不穩(wěn)定的數(shù)量性狀的測定工作上，在分子水平上還沒有系統(tǒng)展開。為此，在種子蛋白質(zhì)分子的多樣性研究中必須充分利用我國豐富的玉米種質(zhì)資源，為我國走向多樣化優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的育種研究提供理論指導及遺傳資源支持。

本研究立足于玉米醇溶谷蛋白解析，并對結果進行聚類分析，從分子水平上揭示我國玉米材料資源的多樣性,促進玉米營養(yǎng)品質(zhì)的育種研究，為特種玉米材料蛋白質(zhì)的遺傳育種學研究奠定基礎，以滿足玉米籽粒產(chǎn)業(yè)的多樣化社會需求。

1 材料與方法

1. 1 材料

所選150份玉米材料是保存在山西省農(nóng)業(yè)科學院品種資源研究所種質(zhì)庫內(nèi)的育種高代品系或具有特殊農(nóng)藝性狀的育種資源品系。其中：早熟普通玉米1～47，共47份；晚熟普通玉米113～143，145～150，共37份；黑糯玉米48～68，共21份；白糯玉米69～73，77～83，100～112，共25份；爆裂玉米74～76，84～88，94～99，144，共15份；黑甜玉米89～93，共5份。

1.2 方法

(1) 表型鑒定。將150份玉米材料進行田間種植、室內(nèi)考種，鑒定其主要植物學特征、農(nóng)藝特點；對于種質(zhì)形態(tài)性狀(如株高、穗位高、粒形、粒色、軸色、穗行數(shù)、行粒數(shù)、穗長、百粒重等)進行重復鑒定(重復數(shù)次)，并對一些重要的農(nóng)藝性狀(如生育期、抗病性、抗逆性)進行鑒定，將這兩類鑒定結果進行初步分類整理[8]。

(2) 提取醇溶蛋白。參照Tian等的方法[9]，提取醇溶谷蛋白。每份材料各取1粒種子,去胚后用研缽磨碎,然后稱取研磨后的粉末0.115 g,倒入1.5 mL離心管中,加入300 μL樣品提取液在12℃下振蕩2 h；14 000 rpm下離心15 min后，在650 μL的上清液中，加入等體積的4℃超純水，清洗醇溶谷蛋白沉淀，沉淀中加入400 μL的蛋白質(zhì)溶解緩沖液，所得蛋白質(zhì)溶液用于SDS-PAGE。

(3) 電泳、染色和照相。使用pH為8.3的電泳緩沖液、8℃的恒溫冷卻循環(huán)水，采用時間分段升壓法進行電泳。每個樣品上樣量為10 μL。在500 V恒壓條件下電泳6 h。電泳結束后,使用含有0.1%(w/v)考馬斯亮藍R-250、50%(v/v)甲醇、10%(v/v)乙酸的染色液進行凝膠染色12 h,用蒸餾水沖洗3～5次,使用含有25%甲醇和10%乙酸的脫色液進行凝膠背景脫色直至譜帶清晰,統(tǒng)計并拍照保存。

(4) 等電聚焦(IEF)電泳法測定蛋白質(zhì)的等電點。用IEF樣品緩沖液提取分析樣品，洗干凈兩塊IEF專用玻璃板，進行硅化和反硅化處理，放上夾條，夾好夾子。配膠、灌膠，待膠凝好后，將塑料墊片底部擦干，放于電泳槽上。在膠面兩邊各放一根浸透電極緩沖液的電極條。在膠面上任意位置放上擦鏡紙片，在紙片上加樣，蓋蓋子，橫功率25 W電泳，待電流達4 mA以下，停止電泳。取出塑料片，放入固定液中15 min，取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至條帶出現(xiàn)即脫色保存。

(5)數(shù)據(jù)處理。按同一遷移率電泳條帶有的記為1,無則記為0來詳細記錄醇溶蛋白電泳譜帶。結果顯示,供試的150份材料，遷移率不同的譜帶類型13條。然后進行統(tǒng)計，按0∶1的方式將觀察到的實驗結果記錄到計算機上統(tǒng)計成Excel文件。計算材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)。

GS=2Nij/(Ni+Nj)

式中：Ni為材料i中出現(xiàn)的譜帶數(shù)；Nj為材料j中出現(xiàn)的譜帶數(shù)；Nij為材料i和材料j中共有的譜帶數(shù)。

根據(jù)遺傳相似系數(shù)計算出遺傳距離(GD)。

GD=1-GS

參考對照材料的標準電泳圖譜,形成醇溶蛋白原始數(shù)據(jù),用分析軟件NT-sys 2.10e進行統(tǒng)計和聚類分析[11，12]。

2 結果與分析

2.1 醇溶谷蛋白的SDS-PAGE結果

采用SDS-PAGE技術，根據(jù)蛋白的溶解度和分子量的不同，可將玉米醇溶谷蛋白分為三類：α，β，γ。α醇溶谷蛋白的分子量為21 000～25 000和19 000(Hasting，1984；Wilson，1985b)；β醇溶谷蛋白的分子量為17 000和18 000(Esen,1987)；γ醇溶谷蛋白的分子量為27 000(Esen,1987)。從所選擇出的15個材料的醇溶谷蛋白的SDS-PAGE圖譜，可以看出γ醇溶谷蛋白的分子量大約為27 000，α醇溶谷蛋白的分子量在21 000～27 000，β醇溶谷蛋白的分子量大約為17 000。使用凝膠成像系統(tǒng)與圖像分析軟件，分析150份玉米自交系種子醇溶谷蛋白的各組分的組成、分子量等生化性狀，發(fā)現(xiàn)在電泳凝膠上普通玉米“PC130”自交系的γ，α，β醇溶谷蛋白組分的生化性狀與相關文獻報道的結果基本一致，其表型特征在所有自交系材料中的發(fā)生頻度最高(圖1)?；诖?，“PC130”被確定為對照、用于其它自交系醇溶蛋白各組分的性狀表征。

圖1 玉米種質(zhì)資源醇溶谷蛋白的SDS-PAGE1. 對照(PC130)；2.運系98-3；M.分子量標準

圖2 γ醇溶谷蛋白帶型的多樣性1.對照；2.分子量偏低；3.分子量偏高；4.相對表達量高；5.相對表達量低；M.Mark

從電泳圖譜圖2可以看出，γ醇溶蛋白的差異性主要表現(xiàn)在分子量和相對表達量上。材料2的γ醇溶谷蛋白分子量偏低，材料3的γ醇溶谷蛋白分子量偏高；材料4的γ醇溶谷蛋白相對表達量高，材料5的γ醇溶谷蛋白相對表達量低。

從電泳圖譜圖3可以看出，β醇溶谷蛋白的差異性主要表現(xiàn)在分子量和相對表達量上。材料6的β醇溶谷蛋白的分子量偏高，材料7的β醇溶谷蛋白分子量偏低；材料8的β醇溶谷蛋白相對表達量少，材料9的β醇溶谷蛋白相對表達量多。

圖3 β醇溶谷蛋白帶型的多樣性1.對照；6.分子量偏低；7.分子量偏高；8.相對表達量高；9.相對表達量低；M.Mark

圖4 α1醇溶谷蛋白帶型的多樣性1.對照；10.一條帶；11.兩條帶；12.集中；13.相對表達量高；M.Mark

從圖4和圖5可以看出，α醇溶谷蛋白包括α1和α2。α1的差異性主要表現(xiàn)在蛋白條帶數(shù)的多少與相對表達量上，材料10的α1醇溶谷蛋白有一條帶；材料11的α1醇溶谷蛋白有兩條帶；材料12的α1醇溶谷蛋白集中，材料13的α1醇溶谷蛋白相對表達量高。α2的差異性主要表現(xiàn)在蛋白條帶數(shù)目上，材料14的α2醇溶谷蛋白有5條帶，材料15的α2醇溶谷蛋白有2條帶，材料16的α2醇溶谷蛋白有2條帶，材料17的α2醇溶谷蛋白有3條帶。

圖5 α2醇溶谷蛋白帶型的多樣性14. 5條帶；15.兩條帶；16.兩條帶；17. 3條帶；1.對照;M.Mark

從150份玉米材料的電泳圖譜上統(tǒng)計結果表明：玉米材料間醇溶谷蛋白具有豐富的遺傳多樣性，主要表現(xiàn)在三個方面：分子量的高低不同，電泳條帶數(shù)目的不同以及相對表達量的不同。

2.2 等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)電泳分析結果

每個材料之間分子量相近，很難區(qū)分分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分。為了詳細解釋醇溶谷蛋白的變異，分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分，利用等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)電泳法測定了蛋白質(zhì)的等電點。等電聚焦(IEF)是一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術，可以分辨等電點(pI)只差0.001 pH單位的生物分子，其分辨力高，重復性好，樣品容量大，操作簡便。如圖6所示，150份供試材料中共檢測到13條具有不同遷移率的譜帶，而且13條變異帶在每個材料中以不同的組合、表達量高低和缺失存在，顯示出供試玉米材料在醇溶蛋白位點變異豐富，在等位基因水平上具有豐富的遺傳多樣性。

圖6 利用等電聚焦(IEF)電泳法篩選出的13條變異類型

2.3 150份參試玉米材料醇溶蛋白聚類分析

用非加權成對群算術平均法(UPGMA)對150份玉米材料進行聚類分析。將聚類結果與它們的農(nóng)藝性狀進行比較,對實驗材料按照形狀進行分類，分為：生育期在110 d以下的為早熟普通玉米、生育期在110 d以上的為晚熟普通玉米、白色糯玉米、爆裂玉米、黑色糯玉米和黑甜玉米共6類。同時對各類玉米材料進行分別聚類分析。

2.3.1 早熟普通玉米材料醇溶蛋白聚類分析

早熟普通玉米材料47份，在遺傳相似系數(shù)為0.56全部聚為一類,遺傳相似系數(shù)為0.58時聚為三大類。第一類包括42個材料,它們又可劃分為2個亞群。第1亞群包含21個材料,第二亞群只有39號材料。第二類只有29號材料。第三類含4個材料，在遺傳相似系數(shù)為0.67時分成兩個亞群，第一亞群包含13，14號材料，第二亞群包含42，43號材料。

2.3.2 晚熟普通玉米材料醇溶蛋白聚類分析

晚熟普通玉米材料37份，在遺傳相似系數(shù)為0.48時全部聚為一類,遺傳相似系數(shù)為0.60時聚為三大類。第一類包括34個材料,它們又可劃分為2個亞群。第1亞群包含33個材料,第二亞群只有134號材料。第二類包含42，43號2個材料。第三類只有148號材料。

2.3.3 白糯玉米材料醇溶蛋白聚類分析

白糯玉米材料25份，在遺傳相似系數(shù)為0.49全部聚為一類,遺傳相似系數(shù)為0.62時聚為三大類。第一類包括29號材料。第二類包括17個材料,它們又可劃分為2個亞群。第1亞群包含14個材料；第二亞群包含3個材料，在遺傳相似系數(shù)為0.74時分成兩個亞群，第一亞群只有78號材料，第二亞群包含77，79號材料。第三類含3個材料，在遺傳相似系數(shù)為0.74時分成兩個亞群，第一亞群只有71號材料，第二亞群包含101，104號材料。

2.3.4 爆裂玉米材料醇溶蛋白聚類分析

15份爆裂玉米材料，在遺傳相似系數(shù)為0.66時全部聚為一類,遺傳相似系數(shù)為0.72時聚為三大類。第一類包括2個材料,遺傳相似系數(shù)為0.85時它們又可劃分為2個亞群。第1亞群是74號材料,第二亞群是76號材料。第二類含12個材料，在遺傳相似系數(shù)為0.75時分成兩個亞群，第一亞群包含11個材料，第二亞群只有98號材料。第三類是144號材料。

2.3.5 黑糯玉米材料醇溶蛋白聚類分析

21份黑糯玉米材料，在遺傳相似系數(shù)為0.58時全部聚為一類,遺傳相似系數(shù)為0.69時聚為三大類。第一類包括17個材料,遺傳相似系數(shù)為0.79時，它們又可劃分為2個亞群。第1亞群包含14個材料,第二亞群在遺傳相似系數(shù)為0.90時可劃分為2個亞類，第一亞類包含49，53號材料，第二亞類只有57號材料。第二類含3個材料，在遺傳相似系數(shù)為0.79時分成兩個亞群，第一亞群包含50，58號材料，第二亞群是66號材料。第三類是62號材料。

2.3.6 黑甜玉米材料醇溶蛋白聚類分析

5份黑甜玉米材料，在遺傳相似系數(shù)為0.42時全部聚為一類,遺傳相似系數(shù)為0.51時聚為兩大類。第一類是89號材料。第二類包括4個材料，遺傳相似系數(shù)為0.68時它們又可劃分為2個亞群，第1亞群包含3個材料,第二亞群只有92號材料。

3 小結與討論

(1)利用SDS-PAGE技術系統(tǒng)檢測了試供玉米材料的醇溶蛋白譜帶，結果表明，150份供試材料的分子量高低不同，電泳條帶數(shù)目的不同以及相對表達量的不同。

(2)利用等電聚焦(IEF)電泳法共檢測到13條具有不同遷移率的譜帶,顯示出供試玉米材料在醇溶蛋白位點變異豐富，在等位基因水平上具有豐富的遺傳多樣性。

(3)根據(jù)聚類分析可以將全部供試材料分為6大類。選擇遺傳距離較大的材料作為親本進行雜交,預期后代將獲得較大的超親分離現(xiàn)象。例如采用遺傳距離較遠的早熟普通玉米39號材料和13，14號材料雜交，其F1代的產(chǎn)量明顯高于13和14號材料雜交的產(chǎn)量。對玉米醇溶蛋白遺傳多樣性進行分析,也發(fā)現(xiàn)其具有豐富的遺傳多樣性且與材料的來源地有關。對材料進行聚類分析，是研究材料間遺傳差異和種質(zhì)利用的基礎，也是雜交育種、親本選配的重要參考依據(jù)。

本試驗所選用的150份玉米材料基本上都為具有某些優(yōu)異特性的資源，可以通過研究發(fā)現(xiàn)其中的有益基因，用于指導、輔助育種研究。研究它們之間的遺傳關系,明確玉米屬種質(zhì)親緣關系的遠近，對于進一步利用玉米優(yōu)異特性具有重要意義。根據(jù)聚類結果制定系統(tǒng)的育種計劃，可以避免推廣材料間的遺傳背景日趨單一的狀況,這也為玉米的高產(chǎn)育種奠定了選擇種質(zhì)資源的理論基礎。因此，在甜玉米、糯玉米、爆粒玉米等特種玉米雜交育種中，大規(guī)模地調(diào)查親本材料間的遺傳背景，有目的有計劃地選擇遺傳距離較遠的雙親材料，重視開發(fā)利用玉米農(nóng)家種和野生資源的優(yōu)良基因，生物技術與常規(guī)育種技術有機結合，對于科學組配雜交親本,加速玉米育種進程有著廣闊的應用前景。

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S513.01

A

1001-5280(2012)01--03

10.3969/j.issn.1001-5280.2012.01.