張海峰 吳興 丁曉凌 強(qiáng)暉 曹維 陳海琴 周國雄

·論著·

趨化因子CXCL11在急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織的表達(dá)及其作用

張海峰 吳興 丁曉凌 強(qiáng)暉 曹維 陳海琴 周國雄

目的觀察趨化因子CXCL11在急性壞死性胰腺炎(ANP)病程中的動態(tài)變化，探討其在ANP發(fā)病過程中的作用。方法48只SD大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組和ANP組，每組24只。采用4%牛黃膽酸鈉(1 ml/kg體重)逆行胰膽管注射方法制備ANP大鼠模型。術(shù)后1、3、6、12 h處死大鼠，留取標(biāo)本。檢測血清淀粉酶活性，胰腺組織行常規(guī)病理檢查并評分，免疫組化法檢測胰腺組織CXCL11表達(dá)，定量PCR法檢測胰腺組織CXCL11 mRNA 表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測血清CXCL11水平。結(jié)果ANP組大鼠血清淀粉酶活性較對照組顯著升高[6 h時為(6153±355)U/L比(185±32)U/L，P<0.05]；胰腺病理損傷明顯，病理評分較對照組顯著增加[6 h時為(9.00±0.63)分比(0.33±0.12)分，P<0.05]；胰腺組織CXCL11 mRNA及蛋白表達(dá)較對照組顯著增強(qiáng)(6 h時為3.13±0.43比0.99±0.24，2.76±0.27比0.33±0.12，P值均<0.05)；血清CXCL11水平較對照組明顯升高[6 h時為(112.1±14.2)ng/L比(56.8±4.3)ng/L，P<0.05]。結(jié)論CXCL11是急性胰腺炎早期的炎癥介質(zhì)，參與了大鼠ANP的發(fā)病過程。

胰腺炎，急性壞死性； 趨化因子類； CXCL11

趨化因子CXCL11又稱I-TAC,全稱為干擾素誘導(dǎo)T細(xì)胞α趨化因子，由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、支氣管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞分泌。其受體CXCR3主要在Th1細(xì)胞表達(dá)，在炎癥局部發(fā)揮誘導(dǎo)炎性細(xì)胞聚集的作用。有研究表明，在慢性胰腺炎中CXCL11及CXCR3表達(dá)明顯增加，但在重癥急性胰腺炎中CXCL11是否參與尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺及血清CXCL11的表達(dá)，探討其在ANP發(fā)病過程中的作用機(jī)制。

材料與方法

一、動物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

健康SD大鼠，清潔級，雌雄不限，體重(220±20)g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。按數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成ANP組及對照組，每組24只。參照Lankisch等[1]方法，以0.1 ml/min的速度向膽胰管內(nèi)注射4%?；悄懰徕c1ml/kg體重制備ANP模型。對照組僅翻動胰腺2次后關(guān)腹。術(shù)后1、3、6、12 h分批抽血處死大鼠。

二 、檢測指標(biāo)與方法

1．淀粉酶測定：采用碘-淀粉比色法，由深圳邁瑞半自動生化分析儀測定，按照試劑盒說明書操作。

2．胰腺病理學(xué)檢查：胰腺組織經(jīng)HE染色后，由兩位專業(yè)的病理醫(yī)師雙盲閱片。每組每個時間點(diǎn)取3張切片，每張切片選取10個高倍鏡視野，參考Rongione等的評分標(biāo)準(zhǔn)，從水腫、感染、出血和壞死4方面進(jìn)行評分(表1)，取各項積分和為最終得分。

表1 胰腺組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)

3．胰腺組織CXCL11蛋白檢測：采用常規(guī)免疫組織化學(xué)方法檢測。兔抗鼠CXCL11抗體購自上海勁馬生物公司，工作濃度1∶100。以公司提供的陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。用彩色病理圖像分析系統(tǒng)采集圖像。由兩位病理醫(yī)師雙盲閱片。細(xì)胞質(zhì)、核膜或胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片隨機(jī)觀察10個不同視野，計數(shù)陽性細(xì)胞，計算其占總細(xì)胞的百分比。

4．CXCL11 mRNA檢測：采用定量PCR法。應(yīng)用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取胰腺組織總RNA，根據(jù)Genbank中基因序列自行設(shè)計引物，由上海生工生物工程有限公司合成。CXCL11引物序列為5′-GGCTGACAAAGTTGAAGTGA-3′和5′-CCA-AGACAGGAGAGGGTCAG-3′，產(chǎn)物191 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列為5′-AAGGTGGTGAAGCAGGCGGC-3′和5′-GAGCAATGCCAGCCCCAGCA-3′，產(chǎn)物130 bp。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃ 15 min，95℃ 15 s、57℃ 30 s、72℃ 40 s，40次循環(huán)，72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后用圖像掃描儀測定光吸收值，以目的條帶與GAPDH條帶的光吸收值比為mRNA相對表達(dá)量。

5．血清CXCL11水平檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測，試劑盒購自上海勁馬生物公司，嚴(yán)格按說明書操作。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、血淀粉酶變化

術(shù)后1、3、6、12 h對照組大鼠血淀粉酶活性分別為(182±65)、(228±57)、(185±32)、(173±51)U/L，ANP組分別為(2914±503)、(3307±745)、(6153±355)、(7695±105)U/L，ANP組顯著高于同時間點(diǎn)對照組(P值均<0.05)。

二、胰腺組織學(xué)改變及病理評分

對照組大鼠肉眼見胰腺、胰周脂肪組織、網(wǎng)膜均無異常，無腹水；鏡下見細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，小葉結(jié)構(gòu)明確，間質(zhì)無水腫，無壞死、出血。ANP組6 h后肉眼可見大量血性腹水，胰腺水腫、出血、壞死，胰周及網(wǎng)膜可見皂化斑，與周圍組織粘連；術(shù)后1、3 h鏡下見小葉間質(zhì)水腫，點(diǎn)狀出血，炎性細(xì)胞浸潤，部分腺泡細(xì)胞變性壞死，6、12 h見大量炎性細(xì)胞浸潤，片狀出血，小葉結(jié)構(gòu)破壞，腺泡細(xì)胞大量壞死(圖1)。術(shù)后1、3、6、12 h對照組胰腺的病理評分分別為(0.26±0.08)、(0.27±0.09)、(0.33±0.12)、(0.50±0.15)分，ANP組為(5.17±0.75)、(6.67±0.52)、(9.00±0.63)、(11.33±0.84)分，ANP組顯著高于同時間點(diǎn)對照組(P值均<0.05)。

圖1對照組(a)、ANP組(b)大鼠胰腺組織病理改變(HE ×200)

三、胰腺組織CXCL11蛋白表達(dá)

對照組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞弱表達(dá)CXCL11蛋白，術(shù)后1、3、6、12 h的表達(dá)量分別為0.32±0.08、0.27±0.09、0.33±0.12、0.40±0.15，無顯著變化；ANP組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞CXCL11蛋白表達(dá)量明顯增加(圖2)，術(shù)后1、3、6、12 h的表達(dá)量分別為1.28±0.18、1.88±0.22、2.76±0.27、3.89±0.32，隨時間延長而增加，且均顯著高于同時間點(diǎn)對照組(P值均<0.05)。

圖2對照組(a)、ANP組(b)大鼠胰腺組織CXCL11蛋白表達(dá)(免疫組化 ×400)

四、胰腺組織CXCL11 mRNA表達(dá)

術(shù)后1、3、6、12 h對照組大鼠胰腺組織CXCL11 mRNA表達(dá)量分別為1.12±0.22、1.01±0.15、0.99±0.24、1.01±0.32，無明顯變化；ANP組大鼠表達(dá)量分別為1.31±0.22、2.10±0.34、3.13±0.43、2.81±0.37，隨時間延長而逐漸升高，且較同時間點(diǎn)對照組顯著增加(P值均<0.05，圖3)。

圖3胰腺組織CXCL11 mRNA的PCR擴(kuò)增曲線(a)和熔解曲線(b)

五、血清CXCL11水平

術(shù)后1、3、6、12 h對照組大鼠血清CXCL11水平分別為(60.3±4.5)、(53.0±7.8)、(56.8±4.3)、(57.2±9.0)ng/L，ANP組分別為(82.2±11.3)、(94.0±9.9)、(112.1±14.2)、(102.5±13.1)ng/L，ANP組較同時間點(diǎn)對照組顯著升高(P值均<0.05)。

討 論

重癥急性胰腺炎(SAP)患者病死有二個高峰[2-4]。第一個是在病程第1周，由于胰酶的激活、胰腺的自身消化及胰酶釋放入血激活巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放大量炎癥因子(包括各種細(xì)胞因子)，觸發(fā)炎癥介質(zhì)瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)[5-7]，通過血液循環(huán)和淋巴管途徑，輸送到全身，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致多臟器功能障礙，微循環(huán)衰竭而病死；第二個是在發(fā)病后2～6周，多由于感染和菌血癥、膿毒血癥引起。

越來越多的研究表明，CXC和CC類趨化因子在輕癥急性胰腺炎(MAP)向SAP演變及SAP的局部和全身并發(fā)癥中起了重要作用 。應(yīng)用趨化因子阻斷劑可明顯降低SAP的嚴(yán)重程度，減少SAP并發(fā)癥，并提高療效[8-14]。Brady等[9]以雨蛙肽和牛磺膽酸鈉分別誘導(dǎo)大鼠水腫型和壞死型急性胰腺炎模型，結(jié)果顯示胰腺組織MCP-1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，并且其表達(dá)強(qiáng)度與胰腺炎的輕重程度呈正比。Bhatia等[8]報道，用BX471拮抗CCR1促中性粒細(xì)胞的歸巢，可減輕胰腺炎病情；拮抗CXCR2可減輕胰腺炎及其肺損傷程度。

CXCL11是非ELR類趨化因子，主要表達(dá)在正常個體胸腺、脾、肺、胰腺等器官的星形膠質(zhì)細(xì)胞、支氣管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等[7]，在生理情況下表達(dá)量較少。有資料表明，CXCL11-CXCR3系統(tǒng)的細(xì)胞趨化作用是免疫炎癥反應(yīng)的一個重要環(huán)節(jié)[15-16]，參與在炎癥、感染、腫瘤、應(yīng)激、自身免疫、變態(tài)反應(yīng)、移植排斥反應(yīng)、AIDS、淋巴細(xì)胞歸巢以及新生血管形成等眾多病理生理的發(fā)生發(fā)展過程[17-18]。在炎癥、感染等條件下，IFN刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生CXCL11，后者刺激活化的T細(xì)胞遷移，同時產(chǎn)生IFN等細(xì)胞因子，形成正反饋回路。

本研究結(jié)果顯示，對照組胰腺CXCL11 mRNA及蛋白表達(dá)很弱，血清CXCL11水平很低。ANP組大鼠胰腺CXCL11 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，且與胰腺的病理損傷呈正比，血清CXCL11水平也升高，證實(shí)CXCL11是急性胰腺炎早期的炎癥介質(zhì)，檢測血清CXCL11水平的動態(tài)變化或許可以幫助判斷急性胰腺炎的病變程度。

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ExpressionandroleofchemokineCXCL11inpancreasofratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHANGHai-feng,WUXing,DINGXiao-ling,QIANGHui,CAOWei,CHENHai-qin,ZHOUGuo-xiong.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China

ZHOUGuo-xiong,Email：zhouguoxiong@medmail．corn．cn

ObjectiveTo investigate the dynamic expressions of CXCL11 and its role in the pathogenesis of acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into control group and ANP group, with 24 rats in each group. ANP model was induced by retrograde injection of 4% sodium taurocholate (1 ml/kg body weight) into the biliary and pancreatic duct. The rats were sacrificed at 1, 3, 6, 12 hours. Serum level of amylase was determined, pathological changes in pancreatic tissue were routinely observed and scored. The expression of CXCL11 mRNA and proteon in pancreas was measured by fluorescence quantitative polymerase chain reaction and immunohistochemical method. The serum levels of CXCL11 were measured by enzyme-linked immunoadsorbent assay.ResultsThe serum levels of amylase in ANP rats were significantly higher than those in control group [(6153±355)U/Lvs(185±32)U/L at 6 h,P<0.05], pathological changes in pancreatre tisues were more significant in ANP rats, and the pathological score was significantly higher than that in control group [(9.00±0.63)vs(0.33±0.12) points at 6 h,P<0.05]; the expressions of CXCL11 mRNA and protein in pancreatic tissue were significantly increased than those in control group (3.13±0.43vs0.99±0.24, 2.76±0.27vs0.33±0.12 at 6 h,P<0.05). The serum level of CXCL11 was significantly higher than that in control group [(112.1±14.2)ng/Lvs(56.8±4.3)ng/L at 6 h,P<0.05)].ConclusionsCXCL11 is an early inflammatory mediator in acute pancreatitis, and involved in the pathogenesis of ANP in rats.

Pancreatitis, acute ncerotizing； Chemokines, CXC; CXCL11

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.06.009

南通市社會發(fā)展基金(S5054)

226001 江蘇南通，南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化科(張海峰、丁曉凌、強(qiáng)暉、曹維、陳海琴、周國雄)；江蘇省泗洪縣人民醫(yī)院消化科(吳興)

周國雄，Email: zhouguoxiong@medmail.com.cn

2012-04-28)

(本文編輯：呂芳萍)