秦榮，張偉，劉煒煒，張建云，黃家風(fēng)

（石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是一種寄主范圍非常廣范的植物病毒，能夠侵染85科365屬1000多種單子葉植物和雙子葉植物，并且常與其它病毒以復(fù)合侵染的方式危害不同的作物。CMV與番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）復(fù)合侵染是造成新疆加工番茄壞死條斑病的重要因素［1－2］，嚴(yán)重影響其品質(zhì)和產(chǎn)量。利用基因工程原理將病毒本身的一些基因轉(zhuǎn)化至植物基因組中獲得抗性植株是當(dāng)前病毒病防治的主要途徑。

轉(zhuǎn)錄后基因沉默是植物在進(jìn)化過程中形成的針對(duì)外源核酸分子入侵（如病毒侵入、轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)座子）的自我防衛(wèi)機(jī)制，在dsRNA的誘導(dǎo)作用下，能夠高效、特異地降解與dsRNA同源的mRNA分子。如果將植物病毒的cDNA片段構(gòu)建成能編碼dsRNA或自我互補(bǔ)的發(fā)夾型RNA（hpRNA）結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入植物就能誘導(dǎo)植物發(fā)生高效的基因沉默，降解與雙鏈同源的病毒RNA分子，便可獲得抗病的轉(zhuǎn)基因植物［3－4］。利用該方法，Wang等［5］將大麥黃矮病毒（BYDV）的多聚蛋白基因構(gòu)建成反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)入大麥，Hu等［6］將CMV的CP基因、晏立英等［7］將花生條紋病毒（PStV）的CP基因分別構(gòu)建成反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)入煙草，分別獲得高效的抗病毒轉(zhuǎn)基因植株。由于田間病毒往往以復(fù)合侵染的方式危害，因此構(gòu)建針對(duì)2個(gè)或多個(gè)病毒的沉默表達(dá)載體已成為利用該原理進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的迫切需要。

本研究以嚴(yán)重危害新疆加工番茄的2種病毒CMV與ToMV為目標(biāo)，通過重組PCR技術(shù)將ToMV部分移動(dòng)蛋白基因（△MP）和CMV的部分復(fù)制相關(guān)蛋白基因（Rep）進(jìn)行融合，并將其以反向重復(fù)的方式插入到內(nèi)含子兩側(cè)，構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化植物和利用RNA沉默原理進(jìn)行植物廣譜抗病研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、植物表達(dá)載體pBIN438、含黃瓜花葉病毒（CMV）復(fù)制酶Rep基因的質(zhì)粒pMD－Rep、含番茄花 葉病毒 （ToMV）運(yùn)動(dòng) 蛋白（MP）基因的質(zhì)粒pMD－MP由本實(shí)驗(yàn)室提供；含有正向大豆內(nèi)含子的pBlue SK重組質(zhì)粒pBlue SKIntron由丹麥科學(xué)家I.Elisabeth Johansen惠贈(zèng)（以下記作pSK）；pMD18－T Vector、各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶，Taq DNA聚合酶、dNTP等購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒、膠回收試劑盒為北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；PCR引物由華大基因科技股份有限公司合成；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純化。

1.2 △MP－Rep融合基因的獲得

根據(jù)ToMV MP基因和CMV Rep基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物 MP－F和Rep－R，中間引物 M－R和R－M。其序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物序列Tab.1 Sequences of primer pairs for PCR amplification

基因融合分兩步進(jìn)行，首先以pMD－MP為模板，以MP－F和M－R為引物，擴(kuò)增ToMV的MP基因片段；以pMD－Rep為模板，以R－M 和 Rep－R為引物擴(kuò)增CMV的Rep基因片段。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：94℃5min，94℃30s，56℃45s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)，72℃10min。然后將上述獲得的2個(gè)PCR產(chǎn)物混合作為模板，以△MP－F和Rep－R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得ToMV和CMV的融合基因，記作△MP－Rep。

PCR反應(yīng)體系：模板各加1μL；引物各為0.5 μL（濃度為20μmol／L）；PCR Mix 12.5μL；雙蒸水9.5μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：94℃5 min，94℃30s，53℃45s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)，72℃10min。利用瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，割膠回收。

1.3 dsRNA介導(dǎo)融合基因的沉默表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述PCR擴(kuò)增到的融合基因△MP－Rep克隆到載體pMD18－T上，通過PCR篩選目標(biāo)基因以正向方式插入的克隆。

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ切取融合基因△MP－Rep，將其連接到用同樣酶切開的pBlue SKIntron載體的Intron下游，獲得中間質(zhì)粒，記作pSK△MP－Rep－K；用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和PstⅠ切取融合基因△MP－Rep，將其連接到用同樣酶切下的pBlue SK－Intron載體的Intron上游，獲得中間質(zhì)粒，記做：pSK－△MP－Rep－B。然后用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和PstⅠ從pSK△MP－Rep－K上切下Intron和△MP－Rep片段，插入用同樣酶切開的pSK－△MP－Rep－B（切去了Intron）上，獲得被Intron隔開的正、反向插入了△MP－Rep的重組質(zhì)粒，記作pSK－Intron△MP－Rep（i／r）。最 后 用 BamHⅠ 將pSK－Intron△MP－Rep（i／r）上包含Intron在內(nèi)的反向重復(fù)融合基因切下，插入用同樣酶切且已去磷酸化的雙元表達(dá)載體pBIN438上，篩選轉(zhuǎn)化重組體得到△MP－Rep基因的反向重復(fù)植物表達(dá)載體pBIN438－△MP－Rep（i／r）。

圖1 △MP基因和△Rep基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of△MP gene and△Rep gene

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)基因的獲得

2.1.1單個(gè)基因片段的獲得

以pMD－MP為模板，MP－F和 M－R為引物，擴(kuò)增得到約340bp大小的目標(biāo)條帶，克隆測(cè)序后明確該片段為ToMV的MP基因片段，大小為332bp（圖1）；以 pMD－Rep為模板，Rep－R 和 R－M 為引物，擴(kuò)增到約380bp的目標(biāo)條帶，克隆測(cè)序后明確該片段為CMV的Rep基因片段，為379bp（圖1）。

2.1.2融合基因的獲得

將上述獲得的2個(gè)單基因片段同時(shí)作為模板，以MP－F和Rep－R為引物，通過重組PCR獲得約720bp的目標(biāo)條帶，將其克隆到pMD18－T上，經(jīng)測(cè)序和序列分析后明確該片段為ToMV MP基因和CMV Rep基因的融合片段，大小為711bp，記作△MP－Rep（圖2）。為此獲得含有ToMV和CMV 2個(gè)植物病毒基因的融合基因。

圖2 融合基因的△MP－Rep的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of fusion gene△MP－Rep

2.2 含△MP－Rep融合基因反向重復(fù)植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將克隆在pMD18－T上的融合基因△MP－Rep，用引物Rv－m和Rep－R通過PCR反應(yīng)篩選正向插入的克隆。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ切取融合基因△MP－Rep，將其連接到用同樣酶切開的pBlue SK－Intron載體的Intron下游。用引物MPLF和Intron－F通過PCR鑒定擴(kuò)增到約900bp的目標(biāo)條帶（圖3），表明△MP－Rep已成功插入至Intron下游，該片段為反向插入的△MP－Rep和Intron（220bp）片段。將獲得的中間質(zhì)粒記作pSK△MP－Rep－K。

同樣用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和PstⅠ將融合基因△MP－Rep從pMD18－T載體上切下，插入用同樣酶切開的pBlue SK－Intron的Intron上游。用引物組合 MP－LF和Intron－R通過PCR也擴(kuò)增到約900bp的目標(biāo)條帶（圖3），表明△MP－Rep成功插入至Intron上游，該片段為正向插入的△MP－Rep和Intron片段。將獲得的中間質(zhì)粒記作pSK－△MP－Rep－B。

然后用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和PstⅠ從pSK－△MP－Rep－K上切下Intron和△MP－Rep片段，插入用同樣酶切開的去除了Intron的pSK－△MPRep－B上。用引 物 組合 MP－LF／Intron－R 和 MPLF／Intron－F分別進(jìn)行PCR鑒定，都能擴(kuò)增到約900bp的目標(biāo)條帶（圖5），它們分別為正向插入的△MP－Rep與Intron片段、反向插入的△MP－Rep與Intron片段，由此說明，融合基因以反向重復(fù)的方式和Intron一起插入到了pBlue SK－Intron上。通過BamH I酶切進(jìn)一步驗(yàn)證，可以獲得約1700bp（包括Intron和融合基因的反向重復(fù)序列）的電泳條帶，這表明 pSK－Intron △MP－Rep （i／r）載體構(gòu)建成功（圖4）。

圖3 融合基因△MP－Rep在pBlue SK－Intron上的PCR鑒定Fig.3 PCR amplification of fusion gene△MP－Rep from pBlue SK－Intron

圖4 融合基因△MP－Rep在pSK－Intron△MP－Rep（i／r）的酶切鑒定Fig.4 Enzyme digestion analysis of fusion gene△MP－Rep from pBlue－Intron△MP－Rep（i／r）

將上述用BamH I酶切獲得的1700bp片段，插入用同樣酶切且去磷酸化的雙元表達(dá)載體pBIN438上。用引物組合 MP－LF／Intron－R和 MPLF／Intron－F分別進(jìn)行PCR鑒定，都能擴(kuò)增到上述約900bp目標(biāo)條帶（圖5）；用BamH I酶切鑒定再次得到同樣大小的約為1700bp目標(biāo)片段（圖6）。結(jié)果表明，包含Intron在內(nèi)的2個(gè)融合基因△MPRep以反向重復(fù)的方式已連接到pBIN438上，含2種病毒基因的植物表達(dá)載體pBIN438△MP－Rep（i／r）構(gòu)建成功。

圖5 融合基因△MP－Rep在pBIN438上的PCR鑒定Fig.5 PCR amplification of fusion gene△MP－Rep from pBIN438

圖6 融合基因△MP－Rep在pBIN438△MP－Rep（i／r）的酶切鑒定Fig.6 Enzyme digestion analysis of fusion gene△MP－Rep from pBIN438△MP－Rep（i／r）

3 結(jié)論和討論

利用重組PCR技術(shù)將ToMV△MP和CMV△Rep進(jìn)行融合，獲得全長(zhǎng)約711bp的融合基因△MP－Rep，再將其以反向重復(fù)的方式與大豆內(nèi)含子相連，并定向插入到植物表達(dá)載體pBIN438上35S啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成功含2種病毒基因的植物表達(dá)載體pBIN438△MP－Rep（i／r）。

dsRNA是誘導(dǎo)植物基因沉默的關(guān)鍵期起始因子，在植物中表達(dá)形成dsRNA就可以誘導(dǎo)基因沉默。將植物病毒的cDNA片段構(gòu)建成能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生dsRNA的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入植物就能誘導(dǎo)植物發(fā)生高效的抗病毒反應(yīng)。從理論上講，任何一段病毒序列轉(zhuǎn)入植物后通過表達(dá)dsRNA誘導(dǎo)基因沉默，均可誘發(fā)植物的抗病性。就非編碼區(qū)而言，基因序列在病毒種內(nèi)甚至在病毒屬內(nèi)是高度保守的，因此選擇種內(nèi)及屬內(nèi)保守的基因序列，得到的抗病毒植株可對(duì)不同致病力的病毒株系產(chǎn)生抗性，可以獲得較廣的抗病性。因此本研究分別選擇了CMV和ToMV序列高度保守的基因片段作為沉默靶標(biāo)。

在反向重復(fù)序列的長(zhǎng)度選擇上，從理論上來講，dsRNA的長(zhǎng)度達(dá)到21～23bp就可發(fā)生沉默，但實(shí)際應(yīng)用中為了達(dá)到比較好的沉默效果，一般選擇200～500bp的基因片段。片段過大不利于重組質(zhì)粒的遺傳操作，片段太小影響沉默效率［8－9］。因此本研究在進(jìn)行目標(biāo)基因選擇時(shí)，為了既便于遺傳操作，又可以達(dá)到基因沉默的目的，分別選取了379bp的CMV△Rep基因片段和332bp的ToMV△MP基因片段作為目標(biāo)片段。人工構(gòu)建具有間隔序列的反向重復(fù)序列時(shí)，間隔序列可以是任一段核酸，如果是內(nèi)含子則獲得的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好，在大腸桿菌里面復(fù)制更加穩(wěn)定；當(dāng)進(jìn)入植物后能夠被剪切形成沒有冗余的dsRNA，從而增強(qiáng)RNA沉默的效應(yīng)［10］。研究表明，在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成含Intron的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（ihpRNA），則沉默效率與hpRNA相比可從58%提高至96%，甚至可高達(dá) 100%［11－12］。因此，本研究在構(gòu)建雙價(jià)抗病毒dsRNA沉默表達(dá)載體時(shí)成功引入了Intron序列，但是該載體轉(zhuǎn)入植物體后是否可以誘導(dǎo)植物獲得高效、雙價(jià)抗病性，還需要進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化煙草和加工番茄，通過轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定及病毒基因組的表達(dá)量和小分子RNA的積累水平來明確。

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