張碩，葉爾買克，魯建江

（1石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院／新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003；2阿拉山口出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，阿拉山口833418）

產(chǎn)甲烷菌作為一類極端厭氧古菌，存在各類生境和極端環(huán)境中。最早研究起始于19世紀(jì)末，直到20世紀(jì)50年代Hungate厭氧技術(shù)［1］的出現(xiàn)，才使厭氧分離產(chǎn)甲烷菌得到發(fā)展，陸續(xù)分離出多種產(chǎn)甲烷菌。我國的研究起步較晚，20世紀(jì)90年代開始陸續(xù)分離出多株產(chǎn)甲烷菌。隨著生物技術(shù)快速發(fā)展，那些能夠耐極端環(huán)境生存的產(chǎn)甲烷菌越來越受到重視，凍土、苔原、湖底污泥、火山溫泉等都曾有報(bào)道分離出各種嗜冷、嗜熱，耐鹽產(chǎn)甲烷古菌［2］。產(chǎn)甲烷菌作為自然界碳素循環(huán)中生物鏈的最后一環(huán)，只能利用低分子量的有機(jī)物，生成甲烷作為代謝的最終產(chǎn)物，溫室氣體排放到大氣中［3］。沼氣發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷氣，同時(shí)也是一種清潔能源，對(duì)于有機(jī)廢水和固體垃圾處理的可再生利用具有重要意義。沼氣發(fā)酵是一個(gè)極其復(fù)雜微生物代謝過程；影響沼氣發(fā)酵最大因素是溫度的波動(dòng)和溫度的過低。通常冬季氣溫下降，會(huì)導(dǎo)致沼氣產(chǎn)量較低，限制了沼氣工程的推廣和發(fā)展。低溫厭氧發(fā)酵與中溫和高溫厭氧發(fā)酵過程相比，在能量盈余方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢［4］。然而，對(duì)于低溫厭氧發(fā)酵微生物菌群耐冷的生物學(xué)機(jī)制和生理學(xué)研究較少［5］。本文立足低溫厭氧發(fā)酵，從新疆越冬沼氣池篩選分離獲得一株產(chǎn)甲烷菌株SZ－3，兼性嗜冷，且低溫和中溫條件下都能夠產(chǎn)氣，對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性研究和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，并確立了菌株的遺傳學(xué)地位，這項(xiàng)工作為后續(xù)低溫耐冷厭氧發(fā)酵機(jī)理和菌群互營共生關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)獲得優(yōu)良低溫產(chǎn)甲烷菌菌種資源，對(duì)于解決冬季沼氣池低溫發(fā)酵具有理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品來源

污泥樣品采自新疆越冬沼氣池，用滅菌后250 mL厭氧瓶取樣，厭氧瓶中充滿高純氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣。樣品取回后放4℃冰箱密閉儲(chǔ)存［6］。

1.1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

產(chǎn)甲烷菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基（1000mL）：K2HPO40.4g，KH2PO40.4g，NH4Cl 1.0g，MgCl20.1g，酵母浸粉1.0g，L－半胱氨酸0.5g，10mL微量元素溶液，10mL維生素溶液，0.1%刃天青2.0mL（固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂）。培養(yǎng)基加熱煮沸除去氧氣，121℃高壓滅菌15min；滅菌后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，分裝至20mL厭氧管和100mL血清瓶中。

（1）微量元素溶液（1000mL）：MgSO4·7H2O 3g；MnSO4·2H2O 0.5g；NaCl 1g；FeSO4·7H2O 0.1g；CoCl2·6H2O 0.1g；CaCl2·2H2O 0.1g；ZnSO4·7H2O 0.1g；CuSO40.01g；KAl（SO4）2·12H2O 0.01g；H3BO30.01g；Na2MoO4·2H2O 0.01g；NiCl2.6H2O 0.025g；NaSeO 3.6 H2O 0.0003g［7］。

（2）維生素溶液（1000mL）：硫胺素（B1）5.0g，泛酸鈣5.0g，核黃素（B2）5.0g，生物素2.0g，葉酸2.0g，B120.1g，煙酸5.0g，對(duì)氨基苯甲酸5.0g，硫辛酸5.0g。

（3）碳源物質(zhì)及還原劑：1%硫化鈉，5%碳酸氫鈉，2.5mol／L乙酸鈉，25%甲酸鈉，50%甲醇，30%甲胺，30%二甲胺，30%三甲胺。

產(chǎn)甲烷菌完全培養(yǎng)基（100mL）：80mL產(chǎn)甲烷菌無機(jī)鹽滅菌培養(yǎng)基，1%硫化鈉，5%碳酸氫鈉，2.5 mol／L乙酸鈉，25%甲酸鈉，50%甲醇，30%甲胺，30%二甲胺，30%三甲胺各2mL，頂部充滿 H2／CO2（80∶20）混合氣。

產(chǎn)甲烷菌純度鑒定培養(yǎng)基（100mL）：牛肉膏0.4g、胰蛋白胨1g、酵母膏1g、葡萄糖0.1g、纖維二糖0.1g、麥芽糖0.1g、可溶性淀粉0.1g、NaCl 0.05g、半胱氨酸0.05g、0.1%刃天青0.2mL、瓊脂2g。

1.2 方法

1.2.1產(chǎn)甲烷菌的富集培養(yǎng)及分離純化

采集的污泥樣品，加入到產(chǎn)甲烷菌完全培養(yǎng)基中（15℃低溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10d），第一次富集接種量10%，取菌液第二次富集，接種量2%，再進(jìn)行第三次富集，氣相色譜（Shimadzu GC 2010）測定產(chǎn)甲烷量達(dá)到最大，進(jìn)行滾管分離，挑取菌落繼續(xù)接種進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，再次滾管分離，直到鏡檢觀察菌體細(xì)胞形態(tài)一致且熒光顯微鏡下觀察到菌體熒光形態(tài)，最后得到純產(chǎn)甲烷菌株。產(chǎn)甲烷菌只能利乙酸、甲醇等簡單小分子合成甲烷。將純化后菌株接種到產(chǎn)甲烷菌純度鑒定培養(yǎng)基中，15℃低溫厭氧培養(yǎng)10 d，觀察菌株是否生長，生長則表明該菌株不是產(chǎn)甲烷菌或含有互營共生的雜菌，需再純化。

1.2.2低溫產(chǎn)甲烷菌株篩選

純化培養(yǎng)得到的產(chǎn)甲烷菌，能否適應(yīng)低溫條件需要進(jìn)行篩選；將產(chǎn)甲烷菌株接種到pH 7.0產(chǎn)甲烷完全液體培養(yǎng)基中，5℃、20℃、30℃恒溫厭氧培養(yǎng)10d，氣相色譜測定產(chǎn)氣情況，選擇能夠5℃低溫產(chǎn)氣良好，20℃、30℃產(chǎn)氣效果依舊良好的為目的菌株。

1.2.3菌體形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)

菌株的生長曲線測定：厭氧條件下每天抽氣和抽取培養(yǎng)液，測定菌株在最適培養(yǎng)條件下甲烷氣產(chǎn)量和菌體生長量（OD值），以甲烷氣產(chǎn)量（Y1）、菌體生長量（Y2）的對(duì)數(shù)值和時(shí)間繪制生長曲線。菌體形態(tài)學(xué)觀察：采用日本尼康80i紫外熒光倒置顯微鏡，尼康倒置相差顯微鏡觀察。取對(duì)數(shù)生長期樣品8000r／min離心5min，少量磷酸緩沖液（PBS）懸浮，滴片至4～6mm玻片，自然干燥，即可進(jìn)行觀察。

最適溫度、pH、NaCl濃度生長實(shí)驗(yàn)：在完全液體培養(yǎng)基中接種2%的菌株，厭氧培養(yǎng)箱（英國DWS公司）中恒溫培養(yǎng)10d，氣相色譜測定甲烷氣產(chǎn)量。

生長底物：乙酸鈉，甲酸鈉，甲醇，甲胺，二甲胺，三甲胺，H2／CO2（80∶20）為單一的碳源，加入到滅菌后的產(chǎn)甲烷菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，pH7、20℃培養(yǎng)8 d測定是否產(chǎn)生甲烷氣，鑒定菌株能否利用這種碳源［8］。

抗生素實(shí)驗(yàn)：添加四環(huán)素、青霉素、氯霉素、卡那霉素、鏈霉素五種抗生素3200U／mL，20℃、10d觀察產(chǎn)甲烷菌的耐受性。

1.2.4 16SrDNA PCR擴(kuò)增

DNA參照《精編分子生物學(xué)指南》中細(xì)菌基因組制備方法，引物［9］由大連寶生物公司合成PRA46F （5－C／TTAAGCCATGCG／AAGT－3 ），PREA1100R （5－T／CGGGTCTCGCTCGTT G／ACC－3）；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5min，30個(gè)循環(huán)（95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min），最后72℃延伸10min。l%的瓊脂糖凝膠電泳，純化回收PCR產(chǎn)物，連接到pGM－T載體上，轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆，回收質(zhì)粒酶切驗(yàn)證；將PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒送交北京鼎國進(jìn)行測序。

1.2.5系統(tǒng)發(fā)育分析

目的菌株片段DNA序列經(jīng)測序后，提交到NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，將與之同源性較高的16SrDNA序列進(jìn)行ClustalX多重序列比對(duì)，使用MEGA 4.1軟件進(jìn)行bootstrap分析，重復(fù)1000次，p－distance核酸模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［10－11］。

2 結(jié)果分析

2.1 低溫產(chǎn)甲烷菌富集純化及篩選

厭氧富集，亨蓋特滾管分離和反復(fù)挑取菌落純化，相差顯微鏡和熒光顯微鏡下（產(chǎn)甲烷菌輔酶F420受激發(fā)后發(fā)出綠色熒光）觀察菌體細(xì)胞形態(tài)一致；后經(jīng)過純化鑒定獲得兩株純產(chǎn)甲烷菌菌株SZ－1、SZ－3。低溫篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SZ－1菌株不能適應(yīng)低溫生長環(huán)境，5℃、15℃低溫條件下幾乎不產(chǎn)氣，30℃產(chǎn)氣活力良好；SZ－3菌株在5℃、15℃、20℃低溫條件下產(chǎn)氣效果良好，30℃中溫條件下仍能維持良好產(chǎn)甲烷氣效果；因此SZ－3菌株符合篩選要求。

2.2 菌株形態(tài)特征及生理生化特性

SZ－3菌株顯微鏡下觀察為革蘭氏染色陽性，不運(yùn)動(dòng)，20℃培養(yǎng)10d長出菌落，菌落呈黃色，圓形，邊緣整齊，紫外熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)綠色熒光（圖1a），相差顯微鏡下觀察（圖1b）為不規(guī)則球狀，菌體聚集形成假胞體，不規(guī)則裂殖。

圖1 菌株SZ－3紫外熒光顯微鏡和相差顯微鏡成像Fig.1 SZ－3UV fluorescence（a）and phase－contrast（b）micrograph

SZ－3菌株在pH值4～8均能生長，生長最適pH值為7（圖2）。SZ－3菌株在5～40℃均能生長，20℃條件下產(chǎn)氣量最大，菌株生長良好（圖2）。SZ－3菌株在0～0.6mol／L NaCl濃度能夠生長，高于0.6mol／L時(shí)產(chǎn)氣停止，NaCl濃度0～0.4mol／L時(shí)產(chǎn)氣量最大，菌株生長良好（圖2）。

圖2 不同pH﹑溫度﹑NaCl濃度下的甲烷含量Fig.2 Methane production by strain SZ－3at different temperatures，pH values and NaCl concentrations

碳源底物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SZ－3菌株接種單一碳源的底物后，只能利用甲醇、H2／CO2（80∶20）混合氣、甲胺、二甲胺、三甲胺，不能利用甲酸鈉、乙酸鈉等，且該菌株對(duì)5種抗生素均有耐受性。

SZ－3菌株生長曲線（圖3）顯示，第3天開始，產(chǎn)氣量和活細(xì)胞數(shù)成對(duì)數(shù)級(jí)增長，第9天發(fā)酵液pH、底物濃度變化、產(chǎn)物積累抑制菌體生長，進(jìn)入穩(wěn)定期，第11天開始菌體開始大量死亡，進(jìn)入衰亡期。

圖3 SZ－3菌株的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain SZ－3

2.3 菌株序列測定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

以SZ－3菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示大約1000bp左右，與設(shè)計(jì)引物1050bp大小相符，無非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)；測序結(jié)果提交NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，相似性最高的是Methanosarcina（產(chǎn)甲烷八疊球菌屬）的菌株，以此為根據(jù)選擇10株Methanosarcina屬菌株，Mthanothermobacter wolfeii strain DSM 2970菌株作為外群種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

菌株SZ－3與產(chǎn)甲烷八疊球菌屬的4個(gè)菌株的16SrDNA基因序列相似性為99%，根據(jù)同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）可以看出，菌株SZ－3與（M.lacustris）湖沉積甲烷八疊球菌種菌株在同一個(gè)分支里，與Methanosarcina lacustris DQ058823的親緣關(guān)系相近屬于同一種屬。

圖4 基于16SrDNA序列同源性構(gòu)建產(chǎn)甲烷八疊球菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Dendragram of Methanosarcina based on 16SrDNA sequence homology

SZ－3菌株生理生化特征比較（表1）；SZ－3菌株生長最適溫度、pH、NaCl濃度、可利用碳源底物等都和湖沉積甲烷八疊球菌相近；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也表明SZ－3菌株與湖沉積甲烷八疊球菌親緣關(guān)系較近。

表1 SZ－3菌株與其他產(chǎn)甲烷八疊球菌屬菌株主要生理特征比較Tab.1 Comparison of strain SZ－3and other members of Methanosarcina

3 結(jié)論

使用厭氧分離技術(shù)從新疆低溫沼氣池中分離出兩株產(chǎn)甲烷菌菌株SZ－1和SZ－3，其中SZ－3能夠耐受低溫且符合兼性嗜冷篩選要求。SZ－3菌株熒光相差顯微鏡下觀察呈疊形球狀，菌株最適生長溫度20℃，生長最適pH值為7，最適NaCl濃度為0～0.4mol／L；該菌株革蘭氏染色陽性，菌落呈黃色，菌株只能利用甲醇、H2／CO2（80∶20）混合氣、甲胺、二甲胺，三甲胺做為碳源底物進(jìn)行生長；菌株對(duì)于四環(huán)素、青霉素、氯霉素、卡那霉素、鏈霉素5種抗生素均具有耐受性。SZ－3菌株系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示其與湖沉積甲烷八疊球菌親緣關(guān)系較近；結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征，最終確定菌株屬于湖沉積甲烷八疊球菌種。

［1］P H Smith，R E Hungate.Isolation and characterization of methanobacterium ruminantiu mn.sp［J］.Bacteriology，1958，75（6）：713－718.

［2］Guishan Zhang，Na Jiang，Xiaoli Liu，et al.Methanogenesis from Methanol at Low Temperatures by a Novel Psychrophilic Methanogen，"Methanolobus psychrophilus sp".nov.，Prevalent in Zoige Wetland of the Tibetan Plateau［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（19）：6114－6120.

［3］Metje M，F(xiàn)renzel P.Methanogenesis and methanogenic pathways in a peat from subarctic permafrost［J］.Environment Microbiology，2007，9：954－964.

［4］Lettinga G，Rebac S，Zeeman G.Challenge of psychrophilic anaerobic wastewater treatment［J］.Trends Biotechnol，2001，19：363－370.

［5］Nozhevnikova A N，simankova M V，Parshina S N，et al.Temperature characteristics of mcthanogenic archaea and acetogenic bacteria isolated from cold environments.Water Science and Technology［J］.2001，44（8）：41－48.

［6］Sun Z，Zhou Y G，Dong X Z.Characterization and phylo－genetics of a new species of genus methanobacterium［J］.Acta Microbiologica Sinica，2001，41：265－269.

［7］錢澤澍，閔航.沼氣發(fā)酵微生物學(xué)［M］.杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1986.

［8］Cuzin N，Ouattara A S，Labat M，et al.Methanobacterium congolense sp nov，from a methanogenic fermentation of cassava peel［J］.Isem，2001，51（2）：489－493.

［9］Suzuki M T，Rappe M S，Haimberger Z W，et al.Bacterial diversity among small－subunit rRNA gene clones and cellular isolates from the same seawater sample［J］.Applied and Environmental Microbiology，1997，63（3）：983－989.

［10］胡亞東，袁月祥，閆志英，等.一株生長pH較寬的產(chǎn)甲烷菌分離與系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2009，15（4）：554－558.

［11］Xia Ding，Huaiyang Zhou，Zhenmei Lu，et al.Isolation and characterization of a new strain of Methanothermobacter marburgensis DX01from hot springs in China［J］.Anaerobe，2010，16：54－59.

［12］Kevin R，Sowers Stephen F，Baron，et al.Methanosarcina acetivorans sp.nov.，an acetotrophic methane－producing bacterium isolated from marine sediments［J］.Applied and Environmental Microbiology，1984，47（5）：971－978.

［13］Gloria M.Maestrojuan，David R.Boone.Characterization of methanosarcina barkeri MST and 227，methanosarcina mazei S－6T，and methanosarcina vacuolata Z－761T［J］.Systematic and Evolutionary Microbiology，1991，41（2）：267－274.

［14］Maria V，Simankova，Alla N Nozhevnikova.Methanosarcina lacustris sp.nov.，a new psychrotolerant methanogenic archaeon from Anoxic Lake sediments［J］.Systematic and Applied Microbiology，2001，24（3）：362－367.

［15］Maria V，Simankova Oleg R，Kotsyurbenko Michael W.Friedrich，et al.Isolation and characterization of new strains of methanogens from cold terrestrial Habitats［J］.Systematic and Applied Microbiology，2003，26（2）：312－318.