王麗，孫濤，譚超

（宜賓學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，宜賓644007）

癌胚抗原（CEA）是分子量為150～300kD的可溶性糖蛋白，主要是由胎兒時(shí)期的內(nèi)胚層衍出而來的胃腸道及肝胰合成，是國(guó)際公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物之一，目前被普遍應(yīng)用于惡性腫瘤的輔助診斷、療效評(píng)價(jià)和檢測(cè)復(fù)發(fā)［1］。健康成人的血清CEA濃度在2.5ng／mL以下，如果血液中CEA濃度突然升高至此值以上，往往與肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝硬化及肝炎等疾病有很大的關(guān)系［2］。因此，建立一種快速，準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)血液中CEA的含量顯得尤為重要。在眾多的方法中，電流型免疫傳感器由于它檢測(cè)限低、操作簡(jiǎn)單和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而倍受人們的青睞［3］。

普魯士藍(lán)（prussian blue，PB），因其具有化學(xué)穩(wěn)定性高、電化學(xué)可逆性好、成本低制備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)而引起研究人員的高度重視，在電催化、生物傳感器、電顯色、二次電池［4－7］等方面應(yīng)用廣泛。此外，由于其對(duì)過氧化氫具有良好的催化還原作用，被稱為“人造過氧化氫酶”［8］。然而，電子媒介體的滲漏是目前制約電流型傳感器發(fā)展的一個(gè)主要問題。近年來，已有研究［9－11］通過交聯(lián)，與其他材料復(fù)合等方法來克服這個(gè)缺點(diǎn)。

納米顆粒由于具有比表面積大，吸附能力強(qiáng)，生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于吸附固定生物分子，基于納米材料的固載基質(zhì)制備傳感器已成為傳感器領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。納米鉑，作為典型的金屬納米粒子，除了具有一般納米顆粒所擁有的優(yōu)點(diǎn)外，還具有獨(dú)特的催化還原H2O2的性能。Zou Y等［12］利用納米鉑修飾的碳納米管制備了葡萄糖生物傳感器，該電極對(duì)H2O2呈現(xiàn)了高的電催化活性和穩(wěn)定性，Chu X等［13］制備了基于納米鉑／納米金和碳納米管的電流型生物傳感器。

本文以普魯士藍(lán)／納米鉑復(fù)合物膜作為固載基質(zhì)，采用辣根過氧化物酶（HRP）代替常用的牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性吸附位點(diǎn)［14－15］，研制高靈敏的電流型癌胚抗原免疫傳感器。由于HRP和普魯士藍(lán)／納米鉑復(fù)合物膜對(duì)H2O2具有良好的電催化活性，因此它們放大了電流響應(yīng)信號(hào)和提高了免疫電極的靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

CHI 600B型電化學(xué)工作站（上海CHI公司）；B204－S電子天平（瑞士 Metter Toledo公司），BRANSONIC200超聲清洗儀（德國(guó)BRANSONIC ULTRASCHALL公司）。氯鉑酸（美國(guó)Sigma公司）；辣根過氧化物酶（HRP，上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)公司）；癌胚抗體（anti.CEA）、癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白抗原（AFP）（鄭州博賽生物技術(shù)研究所），其他試劑均為分析純，所用水均為二次水。

不同pH的磷酸緩沖溶液（PBS）用0.1mol／L KH2PO4和0.1mol／L Na2HPO4配制，支持電解質(zhì)為0.1mol／L KCl。

1.2 免疫傳感器的制備

將金電極（Ф＝4mm）依次用0.3mm和0.05 mm的A12O3粉拋光使成鏡面，然后依次用蒸餾水、無水乙醇和蒸餾水超聲清洗。隨后把電極置于0.5mol／L的硫酸溶液中在－0.4～1.5V 電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定。

將預(yù)處理的Au電極放入新配的2.5mmol K3Fe（CN）6＋2.5mmol FeCl3＋0.1mol／L KCl和0.1mol／L HCl中，在恒電位＋0.4V下沉積80s，二次水沖洗，然后將其放入0.1mol／L HCl／0.1 mol／L KCl溶液中，在－50～350mV的電位范圍內(nèi)以掃速50mV／s進(jìn)行循環(huán)伏安掃描50圈，室溫晾干即得PB修飾電極（PB／Au）［16］，再將修飾電極置于2.0mmol／L H2PtCl6中，以飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極于－0.2V下電沉積30s，取出，水洗，得納米鉑修飾電極（Pt／PB／Au）［17］。然后將納米鉑修飾電極（Pt／PB／Au）置于癌胚抗體中于4℃過夜。最后，將已制好的電極浸在HRP（2 mg／mL，pH6.0的PBS）中約2h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

將制備的電極懸于緩沖液上方，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定方法

本實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：免疫電極為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，飽和甘汞電極（SCE）作為參比電極。利用循環(huán)伏安法（CV）進(jìn)行電極制備過程的表征。循環(huán)伏安法電位區(qū)間為－0.2～0.5V，掃速為50mV／s。

進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，將修飾有抗體的工作電極置于不同濃度的抗原溶液中孵育10min（25℃），測(cè)試底液為5mL 0.1mol／L（PBS pH＝6.5）＋ 2.8 mmol／L H2O2，以循環(huán)伏安法檢測(cè) CEA 的濃度。電位掃描速度為50mV／s，除特別說明，溫度均控制為（25±0.5）℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 電極在自組裝過程中的電化學(xué)表征

本文采用循環(huán)伏安（CV）考察免疫電極在組裝過程的電化學(xué)性質(zhì)。

圖1為不同修飾電極沉積普魯士藍(lán)后的CV圖。

圖1 不同修飾電極的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammograms of the electrodes at different stages

由圖1可見：修飾電極在PBS pH＝6.5緩沖溶液中呈現(xiàn)出一對(duì)可逆的氧化還原峰（圖1a），這表明普魯士藍(lán)是一種良好的電子媒介體。當(dāng)納米鉑粒子沉積到電極后，氧化還原峰電流值有所下降（圖1b），原因可能是因?yàn)樾纬闪艘粚蛹{米鉑粒子層，它的存在增加了電極表面膜的厚度，阻礙了電子的傳遞。特別是當(dāng)修飾電極依次吸附anti－CEA，辣根過氧化物酶（HRP）后，電流進(jìn)一步降低（圖1c），這是由于大分子抗體和辣根過氧化物酶是非導(dǎo)電性物質(zhì)，阻礙了電子的傳輸。

圖2是納米鉑／普魯士藍(lán)復(fù)合物修飾電極連續(xù)掃描20圈的循環(huán)伏安圖。圖2顯示：氧化還原峰電流基本沒有發(fā)生變化，表明納米鉑／普魯士藍(lán)復(fù)合物的形成一定程度上抑制了PB的泄漏。

圖2 Pt／PB／Au電極連續(xù)掃描的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of the Pt／PB／Au electrodes at continuous scan

為了解修飾電極的反應(yīng)過程，實(shí)驗(yàn)考察了峰電流大小與掃描速率的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。圖3顯示：掃速在30～400mv／s范圍內(nèi)，隨著掃描速度的不斷增加，峰電流值也逐漸增加，且氧化還原峰峰電流值與掃描速率的平方根成正比（v1／2），表明電極氧化還原反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的過程。

圖3 免疫電極的掃速圖Fig.3 Cyclic voltammograms of the modified electrodes at different Scan rates

2.2 免疫電極的催化特性

本實(shí)驗(yàn)利用CV技術(shù)考察了免疫電極的電化學(xué)催化特性。圖4為修飾電極在pH 6.5磷酸緩沖溶液中對(duì)H2O2的電化學(xué)催化響應(yīng)圖。

由圖4可知：在加入H2O2之前，CV圖表現(xiàn)出一對(duì)較好的氧化還原峰（圖4a）；當(dāng)加入2.8mmol／L H2O2后，氧化峰電流明顯減小，還原峰電流顯著增加（圖4b），表明修飾電極對(duì)H2O2有良好的電催化還原性能，同時(shí)也說明該免疫傳感器在底液中加入H2O2確實(shí)有效的放大了電流響應(yīng)信號(hào)，增加了免疫電極的靈敏度。

圖4 免疫電極的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of the immunosensor

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

考察H2O2含量對(duì)電極響應(yīng)性能的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5顯示：當(dāng) H2O2的濃度小于2.8mmol／L時(shí)，隨著H2O2的濃度的增加，還原峰電流迅速增加，然后趨向于穩(wěn)定，這表明H2O2的量在電極表面已經(jīng)達(dá)到飽和。因此，在本實(shí)驗(yàn)中H2O2的量選擇為2.8mmol／L。

圖5 H2O2含量對(duì)免疫電極的影響Fig.5 Influence of the amount of H2O2on the sensor response

由于PB的沉積時(shí)間對(duì)免疫傳感器的性能與有直接的關(guān)系，因此本文采用CV法考察PB沉積不同的時(shí)間對(duì)免疫電極響應(yīng)信號(hào)的影響，結(jié)果見圖6。

從圖6可以看出：隨著PB沉積時(shí)間從20－80s，氧化還原峰的電流逐漸增加，80s時(shí)響應(yīng)電流最大。繼續(xù)增加PB沉積時(shí)間到100s，雖然氧化還原峰的電流增加，但是峰形和峰的可逆性變差。因此，80s是PB的最優(yōu)沉積時(shí)間。

圖6 普魯士藍(lán)的沉積時(shí)間對(duì)免疫電極的影響Fig.6 Effect of the depositional time of prussian blue on the response of the immunoelectrode

2.4 免疫傳感器的響應(yīng)特性

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，采用循環(huán)伏安法測(cè)定免疫電極對(duì)CEA的校正曲線，結(jié)果如圖7所示。

從圖7可以看出：CEA的濃度在1.0～80.0 ng／mL的范圍內(nèi)與單位面積峰電流呈良好的線性關(guān)系。其線性方程為y＝0.2802x－128.06，相關(guān)系數(shù)為0.9951，檢測(cè)線為0.4ng／mL。

圖7 免疫電極的校正曲線Fig.7 Calibration curves for the immunoelectrode

該免疫傳感器的測(cè)定原理是：（1）納米鉑、普魯士藍(lán)、HRP同時(shí)催化了H2O2的還原，顯著放大了電流信號(hào)；（2）當(dāng)抗原與抗體特異性結(jié)合后，其復(fù)合物形成的空間位阻影響了HRP的催化活性中心，同時(shí)也阻礙了普魯士藍(lán)的氧化還原反應(yīng)，并且隨著抗原濃度的增加氧化還原峰電流逐漸減小。

2.5 免疫傳感器的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)后將傳感器于4℃下懸于pH 6.5磷酸緩沖液上方放置1d后，峰電流降低了3.5%，1個(gè)月后僅降低了4.9%。表明該免疫電極穩(wěn)定性良好。

分別取不同批次制備的4支免疫傳感器，對(duì)60 ng／mL的CEA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，其電流響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.5%。表明免疫傳感器有良好的重現(xiàn)性。

將修飾好的電極分別置于含有60ng／mL CEA抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液和含有相同CEA濃度以及不同的干擾物質(zhì)（HCG和AFP）溶液中孵育10min，分別記錄響應(yīng)電流值。結(jié)果顯示，2次測(cè)量結(jié)果的偏差小于4.1%。這表明該免疫傳感器具有良好的選擇性。

3 結(jié)語

本文利用普魯士藍(lán)／納米鉑復(fù)合物膜為固載基底、癌胚抗體為模板免疫分子，成功構(gòu)建了高靈敏的電流型癌胚抗原免疫傳感器，與其他傳統(tǒng)方法相比，該方法是有以下優(yōu)勢(shì)：

（1）納米鉑的引入不僅增加了抗體的固定量，而且它與普魯士藍(lán)均可直接催化還原H2O2，增強(qiáng)了電流響應(yīng)信號(hào)提高了免疫傳感器的靈敏度。

（2）與BSA相比，HRP的引入除了能封閉電極表面的活性位點(diǎn)外，還可以直接催化H2O2，進(jìn)一步提高電極靈敏度。

（3）在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，CEA的濃度在1.0～80.0ng／mL的范圍內(nèi)與單位面積峰電流呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9951，檢測(cè)線為0.4ng／mL。

（4）該傳感器制備方法簡(jiǎn)單，成本低、靈敏度高、選擇性好，有望用于臨床樣品分析。

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