劉 哲，雷鈞濤

（吉林醫(yī)藥學院，吉林省 吉林市 132013）

近年來肺纖維化發(fā)病率和致死率呈不斷上升趨勢，研究表明肺纖維化與機體免疫能力下降以及肺間質(zhì)組織受到損害有直接關系[1]。另外，有報道稱重癥非典型性肺炎，即SARS也和補體系統(tǒng)的激活程度有關[2－3]。

補體系統(tǒng)作為人體重要的免疫防御系統(tǒng)之一，可以抵御外來微生物侵害，并且在維持機體平衡等生理過程方面起著重要作用[4]。目前臨床廣泛應用的抗補體活性藥物大多為非天然產(chǎn)物類補體抑制劑，長期使用易產(chǎn)生各種副作用，且治療費用昂貴以及在適應證選擇等方面存在諸多問題。徐晗、章蘊毅等[5]報道稱，近年來在天然產(chǎn)物中分離出的多種結構類型的抗補體活性成分中，以多聚糖化合物和糖基化蛋白為多，通過體外抗溶血實驗能夠篩選出生物活性較好的一些化合物。植物藥中廣泛存在具有抗補體作用的活性成分，多糖作為主要活性成分之一具有顯著的抗補體活性。研究表明，在許多中草藥中含有多糖成分，其中大多數(shù)為酸性雜多糖，而組成其酸性部分多為葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸[6]，它們對補體活性起到一定的調(diào)節(jié)作用，其作用機制是在補體蛋白上存在識別點，可以識別多糖的結構，從而激活補體系統(tǒng)[7]。因此，以植物藥中多糖用作新型補體抑制劑的研究與開發(fā)，日益受到國內(nèi)外學者的關注。

東北作為我國中藥的重要產(chǎn)區(qū)之一，中草藥資源豐富。許多中草藥在經(jīng)多年臨床應用后，證明具有較好的抗過敏、消炎和免疫調(diào)節(jié)作用，這就為從中尋找有效抗補體活性成分提供了可能。本文選取桔梗、桑皮、杏仁等多種東北道地藥材，通過采用體外溶血試驗考察其總抗補體活性，為天然藥物抗補體活性的進一步研究奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 道地藥材

本文選取蒼術、桔梗、桑皮、杏仁、前胡、獨活等16種東北道地藥材，經(jīng)吉林醫(yī)藥學院雷鈞濤教授鑒定均為正品。藥材粉碎過40目篩，備用。

1.2 試劑

α-萘酚、CaCl2、EGTA、MgCl2、NaCl、NaOH、95%乙醇、乙醚、苯酚、巴比妥鈉、巴比妥、丙酮、硫酸、三氯醋酸、枸櫞酸鈉等均為分析純。

1.3 儀器

R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（步琪，瑞士）；TD-5A型低溫高速離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；Well scan MK3型酶標儀（Thermo Labsyst，芬蘭）；TH2-0型恒溫振蕩器（北京浪華時代科技發(fā)展有限公司）；Freezedryerl8型冷凍干燥器（Labconco公司，美國）。

1.4 動物

豚鼠（200～250g），雌雄不限，吉林大學實驗動物部提供。

2 實驗方法

2.1 提取

實驗采用乙醇滲漉提取。取每種藥材10g，煮沸3次，煮沸后將母液合并、濃縮，用三氯醋酸在4℃下脫蛋白；離心后，取上清液用NaOH中和，流水透析48h；濃縮，經(jīng)乙醇沉淀；沉淀冷凍干燥得粗多糖[8]。

2.2 補體經(jīng)典途徑的溶血活性（CH50）測定[9]

2.2.1 溶液配制

配制5倍濃縮巴比妥緩沖液（5×BBS），使用時稀釋成巴比妥緩沖液（BBS）。2%羊紅細胞（SRBC）：取綿羊血2mL，用BBS洗滌，后以800r·min－1離心3min，重復3次，再以3000r·min－1離心10min，然后用BBS配制成2%SRBC。1000溶血素：用BBS配制成1∶1000溶血素溶液。

供試溶液：分別稱取上述各供試藥材粗多糖4mg。用BBS超聲溶解成1∶1溶液，濃度為5mg·mL－1；分別加BBS稀釋，制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128共8個濃度的供試品溶液。

2.2.2 補體制備及效價測定

取豚鼠股動脈血10mL，4℃放置，凝固1h，以800r·min－1離心5min，取血清，加2mL 2%SRBC，混勻后，以800r·min－1離心5min，取上清作為補體分裝，置-70℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

補體經(jīng)典溶血系統(tǒng)的建立：取補體0.1mL，加入BBS配制成1∶10溶液，再用BBS分別以1／2倍稀釋，配制成1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1280溶液。分別取1∶1000溶血素、各濃度補體、2%SRBC各0.1mL，溶于0.3mL BBS中混勻，于37℃水浴中加熱30min，4℃條件下以5000r·min－1離心10min。分別取上清0.2mL，在405nm測定吸光度。實驗同時設置全溶血組（0.1mL 2%SRBC溶于0.5mL蒸餾水中），詳見表1。以蒸餾水溶血管的吸光度作為全溶血標準，計算溶血率。以補體稀釋倍數(shù)為X軸，溶血百分率為Y軸作圖。選擇達到高溶血率的最低補體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補體濃度。

表1 補體經(jīng)典途經(jīng)溶血實驗中所加各成分的體積（mL）

2.2.3 藥物經(jīng)典途徑抗補體活性測定

取確定臨界濃度的補體與供試品混勻，按照表1加入適量BBS、溶血素和2%SRBC，于37℃水浴加熱30min，4℃條件以5000r·min－1離心10min，分別取上清0.2mL，用酶標儀在405nm下測定吸光度。實驗同時設置多糖對照組、補體組和全溶血組。以供試品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖。

3 結果

3.1 經(jīng)典途經(jīng)篩選結果

將5個不同批次稀釋補體加入溶血體系中，評價其效價。在補體稀釋濃度為1∶10～1∶40時，溶血率接近100%，體系基本達到全溶血。因此以稀釋比例為1∶40的豚鼠血清作為以下經(jīng)典途徑篩選實驗中所使用的補體，見圖1。

圖1 經(jīng)典途經(jīng)不同稀釋度的豚鼠血清的效價（%，n＝5）

3.2 供試藥物經(jīng)典途徑抗補體活性測定結果

根據(jù)“2.2.3”項下，對16種藥材的抗補體活性進行測定，結果表明供試藥材中蒼術的最大溶血抑制率最高，為98.2%，超過相應濃度肝素的最大溶血抑制率，表明抗補體活性良好?？嘈尤实绕渌┰囁幉牡淖畲笕苎种坡拭黠@偏低，表明體外抗補體活性不佳。結果見圖2、圖3。

圖2 供試藥物抗補體活性

圖3 供試藥物抗補體活性

4 討論

目前臨床應用非天然產(chǎn)物類補體抑制劑治療各種肺纖維化，雖然對該病起到一定的治療作用，但長期應用會降低機體的防御機能，可產(chǎn)生多種副作用和并發(fā)癥。傳統(tǒng)中藥中大多數(shù)活性成分可以直接被機體消化吸收，說明從天然產(chǎn)物中開發(fā)出高效、低毒的補體抑制劑是可能的。此外，從天然產(chǎn)物中開發(fā)的補體抑制劑還具有成本低的優(yōu)點。

本文通過對東北16種道地藥材進行體外溶血試驗，旨在篩選出具有一定抗補體活性的天然藥物。結果顯示在供試藥材中藥物濃度在0.08mg／mL時，蒼術的溶血抑制率最大，活性較好，為進一步研究天然藥物在治療肺纖維化、開發(fā)高效低毒天然補體抑制劑奠定基礎。

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