彭建華 張悅 陳建福 張虎祥

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在中國的南部沿海地區(qū)較高。由于其位置深且對放射治療(簡稱放療)敏感，因此放療是NPC首選的治療措施。盡管目前放療技術(shù)及設(shè)備不斷進步，鼻咽癌患者的5年生存率仍然較低［1］。近年來，研究者在人類的多種惡性腫瘤內(nèi)包括乳腺［2］、腦［3］、前列腺［4］、卵巢［5］以及胰腺［6］等均發(fā)現(xiàn)有一小群細胞，這些細胞具有一系列類似于胚胎干細胞的獨特性質(zhì)如多能分化、增殖、影響細胞周期、血管形成以及自我更新等，因此稱為腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)。有研究表明，這些腫瘤干細胞在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療抵抗方面均具有重要意義。但在鼻咽癌組織中是否也存在此類腫瘤干細胞，則報道較少。本研究通過對一組鼻咽癌患者組織內(nèi)腫瘤干細胞進行鑒定，以明確腫瘤干細胞在鼻咽癌組織中的存在，并探討腫瘤干細胞在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所需的材料取自2001年6月～2008年6月于本科門診就診并經(jīng)病理學(xué)確診的32例鼻咽癌患者。患者年齡18～62歲，平均46.6歲。其中5例為高分化鱗癌、18例為中分化角化型鱗癌、9例為未分化型。5例正常人的鼻咽部黏膜作為正常對照。所有的鼻咽部黏膜標本均經(jīng)病理證實。每位患者在取標本前均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) 全部標本均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石臘包埋切片，切片層厚6 μm。切片抗原修復(fù)后，過氧化氫處理，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)室溫下沖洗數(shù)次，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺 (diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)染色，蘇木精復(fù)染，樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。切片做好后，以Nikon顯微鏡及Magnifire彩色數(shù)碼相機獲取圖像。細胞染成棕色且無背景著色者為免疫組織化學(xué)陽性。每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機觀察10個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，陽性細胞數(shù)占全部腫瘤細胞數(shù)百分比(陽性表達率)≥25%為陽性表達，＜25%為陰性表達。

實驗所用的一抗 Ki-67、MCM2、SOX1、PCNA、CD133、nestin、OCT4、SOX2、Notch1、NICD、Jagged1、Hes1以及C-Kit等均由美國BUCK老年病研究所的金坤林教授惠贈。

1.2.2 雙標免疫組織化學(xué) 雙標免疫組織化學(xué)的實驗步驟與上相同，在上述實驗一抗添加后，加入鼠單克隆抗體 Ki-67抗原，二抗為 Alexa Fluor 488-，594-，或647-IgG。通過Axiovert 200倒置顯微鏡觀察圖像，并采用LSM 510 NLO共聚焦成像系統(tǒng)進行圖像采集，三維圖像合成采用Imars軟件進行。待測細胞呈現(xiàn)出特異性熒光染色者為陽性表達。

1.2.3 細胞計數(shù) 增殖指數(shù)被定義為 Ki-67或者PCNA陽性細胞數(shù)目占視野內(nèi)總細胞數(shù)目的百分比。所有的細胞計數(shù)均在400倍的光鏡下進行。血細胞不列入計數(shù)范圍。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)輸入SPSS for Windows軟件內(nèi)進行χ2檢驗，當P＜0.05時，認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

胚胎干細胞的表面標記物SOX2以及OCT4選擇性地在鼻咽癌組織中高表達，其陽性率分別為65.6%(21/32)以及 71.9%(23/32)，而在正常鼻咽組織中則無表達。同時，這些細胞的表面還表達有其他干細胞標記蛋白，如SOX1、nestin以及CD133等(圖1)。

圖1.A:SOX2在正常對照組黏膜中無明顯表達但在鼻咽癌組織中均是高表達;B:OCT4在正常對照組黏膜中無明顯表達但在鼻咽癌組織中均是高表達;C:SOX2在胚胎干細胞中高表達;D:CD-133在正常黏膜中無表達而在鼻咽癌組織中高表達，nestin在正常黏膜中表達很少，而在鼻咽癌組織中高表達

與細胞增殖相關(guān)的蛋白，如 Ki-67、PCNA以及MCM2等在大多數(shù)的鼻咽癌細胞上有表達，其中中分化非角化型(49.3%)以及未分化型(51.5%)的增殖指數(shù)顯著高于高分化角化型(31.2%)(P＜0.05)(圖2)。

與正常鼻咽部組織相比，Notch1受體(陽性率為78.1%，25/32)及其配體 Jagged1(陽性率為 71.9%，23/32)的表達在鼻咽癌細胞中是顯著升高的。同時Notch1受體的激活形式 NICD(陽性率為 68.8%，22/32)以及其下游的靶蛋白Hes1(陽性率為65.6%，21/32)在Notch1陽性細胞上也有表達。雙標免疫組織化學(xué)表明，在NICD陽性細胞上同時也表達Ki-67，表明這些細胞也具有很強的增殖性(圖3)。雙標免疫組織化學(xué)同時還表明在SOX2以及OCT4陽性細胞上，也有NICD的表達。此外，Hes1在此類細胞的表面也有表達(圖4)。

圖2.各型鼻咽癌組織的細胞均具有較高的增殖指數(shù)，分化良好的角化型NPC增殖指數(shù)顯著低于中分化角化型以及未分化型NPC A:為雙標免疫組織化學(xué)結(jié)果;B為免疫組織化學(xué)結(jié)果。其中上排均為低倍鏡，下排均為高倍鏡

圖3.A:鼻咽癌組織中Notch1受體及其配體Jagged1蛋白在鼻咽癌細胞中均有表達;B:Notch1受體活化形式NICD蛋白;C:NICD蛋白下游靶基因蛋白Hes1在Notch1受體陽性細胞上的表達;D:Ki-67在NICD陽性細胞上的表達

圖4.A、B:分別顯示NICD在SOX2以及OCT4陽性細胞上的表達情況;C、D:分別顯示Notch1受體活化形式NICD及其下游靶蛋白Hes1在SOX2及OCT4陽性表達細胞中的表達情況，表明鼻咽癌腫瘤干細胞中Notch1信號途徑是激活的

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞的表面標記物SOX2和OCT4在鼻咽癌組織的一小部分細胞中有表達，而在正常組織中無表達。同時這一部分細胞還表達有其他一些干細胞的表面標記物(圖1)。這一結(jié)果表明，在鼻咽癌細胞組織中也存在著腫瘤干細胞樣細胞。雙標免疫組織化學(xué)進一步顯示這部分細胞增殖相關(guān)蛋白高表達，具有高度的增殖性(圖2)。此外我們還發(fā)現(xiàn)，Notch1受體及其配體在鼻咽癌細胞中也有表達，其受體的激活形式NICD及其下游靶蛋白Hes1等在SOX2和OCT4陽性細胞表面均有表達，這一結(jié)果提示Notch1信號途徑在這些細胞上呈激活狀態(tài)(圖3～4)。

SOX2和OCT4是表達在胚胎干細胞表面的2種重要轉(zhuǎn)錄因子，其對于維持胚胎干細胞的多能分化潛能具有重要作用［7-8］。有研究［9］表明，敲除這2個轉(zhuǎn)錄因子的胚胎干細胞喪失了多能分化潛能。我們的研究表明，這2個重要的胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄因子在人鼻咽癌組織的一小群細胞里面有表達。因此在鼻咽癌組織中也存在著腫瘤干細胞樣細胞。

Notch信號途徑是一個高度保守的信號途徑，主要控制特定細胞的分化、增殖、凋亡以及干細胞發(fā)育過程的維持。其對成體干細胞增殖的控制作用已經(jīng)在多種細胞內(nèi)得到了證實，如血液細胞和神經(jīng)細胞等［10］。近期的研究［11］表明，Notch信號途徑的激活在多種人類惡性腫瘤的形成及進展中均具有重要作用。這些腫瘤包括神經(jīng)纖維瘤、皮膚癌、肺癌以及前列腺癌等。

在與配體結(jié)合后，Notch受體被γ-分泌酶水解從而轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠罨问絅ICD。NICD進入細胞核后可以與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合形成NICD/CSL復(fù)合物，該復(fù)合物可以使CSL從轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)錄活化因子，并最終激活Hes以及Herp等靶基因［12］。本研究中，我們觀察到NICD以及Hes1在鼻咽癌細胞中均有表達，這表明Notch1信號途徑在鼻咽癌細胞中是激活的。更重要的是Notch1信號途徑激活的細胞均是胚胎干細胞標志蛋白陽性的細胞。已有諸多的證據(jù)表明，Notch信號途徑在實體惡性腫瘤的發(fā)生中具有重要意義［13-14］，因此我們推測，Notch信號途徑在鼻咽癌組織中腫瘤干細胞的調(diào)控進而影響鼻咽癌的生物學(xué)特性上具有重要意義。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤干細胞在治療抵抗以及復(fù)發(fā)中具有重要意義，因此靶向腫瘤干細胞的有效治療可以為惡性腫瘤包括鼻咽癌的治療提供一種新的途徑。

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