朱正華 胡炯炯 郭燕明 崔佳文 費(fèi)剛 馬兆鑫

急性分泌性中耳炎(otitis media with effusion，OME)是以中耳積液及聽力下降為主要特征的中耳炎性疾病，是耳鼻咽喉頭頸外科多發(fā)病之一，尤其在兒童發(fā)病率較高［1-2］。臨床治療頗為棘手，若治療不當(dāng)將導(dǎo)致兒童聽力障礙及言語發(fā)育不良。在美國，OME仍然是耳鼻喉科領(lǐng)域尚未解決的臨床難題，每年有2200萬患兒被診斷為OME;藥物治療失敗后，約有100萬兒童不得不接受鼓膜置管治療，造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)40億美元［3-4］。在我國雖然未見準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，但從臨床資料看也不容樂觀。積極有效治療OME對(duì)防聾、治聾具有重要意義。國內(nèi)外學(xué)者在用表面活性物質(zhì)治療OME方面作了許多有益的探索，但是比較系統(tǒng)地建立OME實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并應(yīng)用生物性肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)鼻內(nèi)給藥治療OME還鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 滅活流感嗜血桿菌懸浮液 流感嗜血桿菌由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病原生物系提供，孵育繁殖，制成細(xì)菌懸浮液(磷酸緩沖液pH=7)，每毫升含108菌落或集群。水浴65℃ 30 min滅活細(xì)菌，接種前再做細(xì)菌培養(yǎng)，確保無細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.1.2 外源性肺表面活性物質(zhì) 固爾蘇(curosurf 3.0 mL:0.24 g;豬肺磷脂注射液)，意大利凱西Chiesi Farmaceutici SPA生產(chǎn)，批號(hào)為H20100428。

1.2 造模和分組

1.2.1 豚鼠 OME模型的制作［5］氯胺酮70 mg/kg肌內(nèi)注射+戊巴比妥鈉30 mg/kg皮下注射全身麻醉(下同)。采用滅活的流感嗜血桿菌鼓室內(nèi)注射，建立豚鼠OME的動(dòng)物模型。動(dòng)物模型的評(píng)估:耳內(nèi)鏡下觀察鼓膜，聲導(dǎo)抗鼓室圖，聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)測(cè)聽。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 50只雜色豚鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，健康、耳廓反射靈敏，耳鏡檢查排除外耳道及中耳病變。隨機(jī)取10只作為正常組(A組，隨機(jī)數(shù)字表法，下同);40只造模，5 d后，31只造模成功(雙側(cè)中耳積液、聽力下降)，而后隨機(jī)分為3組:造模組(B組)10只，造模后不作任何治療;生理鹽水組(C組)10只，以生理鹽水滴鼻，給藥方式同PS組;PS治療組(D組)11只。根據(jù) Chandrasekhar等［3］研究的沙土鼠給藥劑量推算，每只豚鼠(體質(zhì)量300～400 g)滴鼻給藥4 mg/d，每次滴鼻含PS 1 mg(用生理鹽水稀釋至0.1 mL)，雙側(cè)鼻腔2 mg，每天給藥2次，連續(xù)7 d。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 鼓膜圖 0°耳內(nèi)鏡(Hopkins 1218A，STORZ公司，德國)。耳內(nèi)鏡檢查正常及OME豚鼠的鼓膜，并拍照存檔。

1.3.2 聲導(dǎo)抗鼓室圖 GSI中耳分析儀(GSI，美國)，1000 Hz純音探頭測(cè)試鼓室壓圖。

1.3.3 ABR 測(cè)聽 ABR 儀(TDT，美國)，全身麻醉下測(cè)定各組豚鼠的ABR閾值，記錄ABR各波潛伏期和反應(yīng)閾的變化。采用透皮針形電極，記錄電極置顱頂中線，參考電極和零電極分置兩側(cè)耳后乳突皮下。聲場(chǎng)開放式揚(yáng)聲器放置頭部前方10 cm，給聲刺激為短聲(click)，聽力級(jí)(dB HL)，刺激頻率 11.1/s，帶通濾波50～3000 Hz，疊加次數(shù)為 1000次，記錄時(shí)程10 ms。測(cè)反應(yīng)閾值時(shí)采用遞減法，近反應(yīng)閾值時(shí)遞減5 dB。記錄ABR閾值及90 dB時(shí) ABR I、III、V波潛伏期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 耳內(nèi)鏡檢查鼓膜圖 A組豚鼠，鼓膜透亮，光錐存在(圖1A)。造模后5 d鼓膜像緊張部前方見穿刺孔愈合，鼓膜充血內(nèi)陷，鼓室積液。1周后B組見穿刺瘢痕，鼓膜充血減退，鼓膜內(nèi)陷，光錐變形、變短，鼓室積液，可見液平(圖1B);C組，較造模后5 d鼓膜充血減退，鼓膜內(nèi)陷，光錐變形，鼓室積液，多數(shù)見液平(圖1C)。D組，鼓膜充血進(jìn)一步消退，形態(tài)大致正常，光錐存在，鼓膜稍渾濁，積液征基本消失(圖1D)。

2.2 聲導(dǎo)抗檢測(cè)

2.2.1 聲導(dǎo)抗鼓室圖形態(tài) A組:鼓室圖A型，尖峰狀，鼓室壓0～ +100 da Pa。B組(鼓室注射后第12天):鼓室圖仍平坦，B或C型鼓室圖，鼓室壓-100～-300 da Pa居多。C組:用藥1周后，與B組類似，B或C型鼓室圖，峰較平坦。D組:1周后，鼓室圖多為B型，鼓室負(fù)壓減小，±100 da Pa之間居多。

2.2.2 鼓室壓 A組聲導(dǎo)抗鼓室壓(34±63)da Pa(均數(shù) ±1.96 SD，95%可信區(qū)間，下同)。B組聲導(dǎo)抗鼓室壓降低到(-135±107)da Pa，和A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。C組鼓室壓(-118±93)da Pa，和B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.257)。D組PS治療1周后，聲導(dǎo)抗鼓室壓為(1±103)da Pa，和B組、C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(表1～2)。PS可以顯著降低OME豚鼠中耳負(fù)壓，改善通氣。

圖1.A:鼓膜透亮，光錐存在(黑色箭頭);B:鼓膜充血，鼓膜充血減退，穿刺孔愈合，鼓膜內(nèi)陷，光錐變形，鼓室積液，見液平(白色箭頭);C:鼓膜充血減退，鼓膜內(nèi)陷，光錐變形，鼓室積液，見液平(白色箭頭);D:鼓膜稍渾濁，光錐存在(黑色箭頭)，鼓室積液消失

表1 各組鼓室壓(da Pa)

表2 各組鼓室壓多重比較LSD

2.3 ABR閾值 A組反應(yīng)閾值為(14.1±4.8)dB HL，B 組為(51.2 ±6.3)dB HL，與 A 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。C組反應(yīng)閾值為(52.8±7.1)dB HL，與 B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.320)。D 組反應(yīng)閾值為(27.4 ±8.8)dB HL，比 B 組和C組的反應(yīng)閾降低了23～25 dB HL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.001)(表3～4)。

表3 ABR閾值(dB)

表4 各組反應(yīng)閾值多重比較LSD

3 討論

OME的病因雖未完全明了，但目前認(rèn)為咽鼓管功能障礙、中耳局部感染和變態(tài)反應(yīng)等是其主要病理基礎(chǔ)，鼓室缺氧［6］，負(fù)壓形成，滲出增多形成積液。咽鼓管功能障礙是OME的主要病因。咽鼓管是平衡鼓室內(nèi)外氣壓的唯一通道，平時(shí)關(guān)閉，吞咽時(shí)開放。它的開放不但與管壁的彈性回縮力有關(guān)，而且受管內(nèi)液體表面張力的影響，要使咽鼓管開放所需壓力必須克服管壁的彈性阻力和液體的表面張力。咽鼓管表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白和磷脂協(xié)同作用形成了降低表面張力的活性特性［7］。咽鼓管表面活性物質(zhì)具有維持咽鼓管通氣、清除和保護(hù)功能［8］。

咽鼓管內(nèi)表面活性物質(zhì)缺乏是咽鼓管功能障礙的重要原因之一。1963年Flisberg［9］等提出了一種物質(zhì)存在于咽鼓管的黏液層，能降低相對(duì)應(yīng)的黏膜表面張力，有利于咽鼓管開放，其成分和PS類似。Hills［10］應(yīng)用薄層色譜法對(duì)犬和兔咽鼓管沖洗液中的表面活性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)有一定量的磷脂存在，主要成分為磷脂酰膽堿。Rapport等［11］研究了生理鹽水沖洗前后豚鼠咽鼓管開放壓的變化，發(fā)現(xiàn)咽鼓管用生理鹽水沖洗后開放壓提高，提示咽鼓管黏液層有能降低表面張力的活性物質(zhì)。生理鹽水沖洗除去了這些表面活性物質(zhì)后，咽鼓管開放壓升高，證明表面活性物質(zhì)在維持咽鼓管正常功能中起著重要作用。Fornadley等［12］注射肺炎鏈球菌于沙土鼠的中耳腔內(nèi)，建立OME模型，用一種表面活性物質(zhì)注入具有OME沙土鼠的咽鼓管內(nèi)，并以鹽溶液和氣體為對(duì)照觀察表面活性物質(zhì)對(duì)咽鼓管開放壓的影響。結(jié)果表明表面活性物質(zhì)能降低咽鼓管開放壓，明顯改善咽鼓管的通氣功能，與對(duì)照組有顯著差異。邱麗華等［13］隨機(jī)選擇OME患者做鼻咽部灌洗液中卵磷脂含量測(cè)定，結(jié)果顯示OME患者卵磷脂含量比正常對(duì)照組明顯減少，提示局部表面活性物質(zhì)減少可能是OME發(fā)病機(jī)制之一。

Van Heerbeek等［14］研究牛PS在豚鼠咽鼓管的作用:外源性表面活性物質(zhì)能減少咽鼓管的閉合力，降低開放壓。Chandrasekhar等［3］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明:壓力定量氣霧劑表面活性物質(zhì)鼻內(nèi)單獨(dú)或與類固醇激素合并給藥，在正?；騉ME動(dòng)物可降低咽鼓管開放壓。

由于外源性咽鼓管表面活性物質(zhì)難以制備，人工合成磷脂的活性遠(yuǎn)較咽鼓管表面活性物質(zhì)差，因此探尋咽鼓管表面活性物質(zhì)的替代品是解決問題的關(guān)鍵。從胚胎發(fā)生學(xué)角度看，咽鼓管也可以看作呼吸道的一部分，咽鼓管的黏膜為纖毛柱狀上皮，是呼吸道黏膜衍化來的改良型呼吸道黏膜，咽鼓管鼓室黏膜在正常狀態(tài)下的纖毛活動(dòng)類似于呼吸道黏膜。Tsuruhara等［15］利用電子顯微鏡觀察，證實(shí)在兔及豚鼠咽鼓管黏膜上有類似PS磷脂層狀小體存在，嗜鋨電子致密層小體是一種磷脂表面活化劑。Coticchia等［16］也用薄層色譜分析法分別測(cè)定了豚鼠咽鼓管沖洗液及肺沖洗液中的表面活性物質(zhì)，并進(jìn)行比較，在咽鼓管沖洗液中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺為5∶1，而在肺內(nèi)為8∶1;在咽鼓管沖洗液中磷脂酰膽堿和鞘磷脂的比為2∶1，而在肺內(nèi)為67∶1。這些表明，咽鼓管表面活性物質(zhì)和PS是相似的，其含量不同可能與咽鼓管和肺組織樣本懸殊所致，但均以磷脂成分為主。

Ghadiali等［17］研究了黏膜表面的影響因素和PS作用于咽鼓管的機(jī)制，去除正常的咽鼓管黏液毯，即除去自身的表面活性物質(zhì)，不能明顯改變咽鼓管開放壓，但能顯著減少咽鼓管的順應(yīng)性并出現(xiàn)滯后現(xiàn)象。PS能顯著降低咽鼓管開放壓，包括減少氣液界面張力，以致顯著增加咽鼓管的順應(yīng)性。Duplessis［18］應(yīng)用表面活性物質(zhì)鼻噴治療潛水人員的中耳氣壓傷，并認(rèn)為咽鼓管的功能(被動(dòng)開放壓)變異較大。

相對(duì)于經(jīng)鼓室給藥，PS經(jīng)鼻給藥是一個(gè)有意義的嘗試。前期研究鼓室給藥取得了較好的療效［19-20］，鼓室給藥屬有創(chuàng)治療，臨床應(yīng)用困難。本研究的主要目的是治療小兒OME，因此研究鼻腔給藥更具有臨床治療意義。聲導(dǎo)抗鼓室圖檢查較耳內(nèi)鏡敏感性高，有動(dòng)物研究表明，聲導(dǎo)抗檢查需要治療更長(zhǎng)時(shí)間才能完全恢復(fù)正常［21］。治療1周后，D組大多數(shù)豚鼠耳內(nèi)鏡檢查基本恢復(fù)正常;鼓室圖檢查仍然為B型(平坦型)。本實(shí)驗(yàn)A組鼓室壓(34±63)da Pa。B組豚鼠聲導(dǎo)抗鼓室壓降低到(-135±107)da Pa。PS治療1周后，聲導(dǎo)抗鼓室壓為(1±103)da Pa(D組)。C組鼓室壓(-118±93)da Pa，和B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PS可以改善通氣，顯著降低OME豚鼠中耳負(fù)壓，對(duì)OME有治療作用。近期有學(xué)者應(yīng)用多普勒振動(dòng)儀觀測(cè)，經(jīng)鼻霧化吸入給藥后，PS可以提高豚鼠鼓膜振動(dòng)速度［22］。同樣，鼓室圖聲導(dǎo)納的分析中發(fā)現(xiàn)，PS可以顯著改善OME豚鼠中耳順應(yīng)性，提高聲順峰值，可以減少傳導(dǎo)性聽力損失。

本試驗(yàn)A組豚鼠反應(yīng)閾值為(14.1±4.8)dB HL。B組反應(yīng)閾值上升到(51.2±6.3)dB HL。C組反應(yīng)閾值為(52.8±7.1)dB HL，和 B 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PS治療后，D組反應(yīng)閾值降至(27.4±8.8)dB HL，與B組、C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明PS滴鼻給藥，可以改善降低OME豚鼠反應(yīng)閾值，對(duì)于OME有治療作用。

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