楊文超，陳湖南，繆曉青*

(福建農林大學蜂學學院，福建 福州 350002)

蓮花蜂花粉酶解破壁工藝條件優(yōu)化

楊文超，陳湖南，繆曉青*

(福建農林大學蜂學學院，福建 福州 350002)

為研究蓮花蜂花粉的最佳酶解破壁條件，通過單因素試驗確定纖維素酶-果膠酶-木聚糖酶-木瓜蛋白酶4種酶制劑的比例，在酶解破壁條件的單因素試驗基礎上，采用二次回歸正交旋轉組合設計試驗方法對酶解條件進行優(yōu)化，建立酶解pH值、復合酶加入量、酶解溫度、料水比與破壁率之間的經驗數(shù)學模型。復合酶中各種酶制劑的最適配比為4:2:1:3。蓮花蜂花粉酶解破壁的最佳條件為酶解pH4.0、復合酶加入量12‰、酶解溫度45℃、料水比1:14(g/mL)，破壁率89.21%。

蓮花蜂花粉；酶制劑；破壁

蜂花粉是蜜蜂采集植物花粉形成的花粉團，具有增強人體免疫力、抗疲勞、美容、延緩衰老和治療前列腺疾病等作用[1-2]。由于花粉壁具有異常耐酸耐堿耐腐蝕的堅硬外壁，將其應用于食品中一般要對花粉進行破壁處理，使其所含營養(yǎng)成分充分地釋放出來。蜂花粉的破壁方法有很多，常見的有機械破壁、溫差破壁、發(fā)酵破壁、超臨界二氧化碳、超微粉碎、液氮淬冷法和單一酶破壁等[3-18]。這些方法普遍存在一些缺點，如營養(yǎng)物質損失多、破壁率不理想、破壁時間長而且易污染。酶解破壁具有反應條件溫和、高效率、破壁率高等優(yōu)點，為探索較好的破壁方法，采用單因素試驗和正交旋轉試驗，利用多種生物酶組成的復合酶體系對蜂花粉進行酶解破壁研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮花蜂花粉 福建省神蜂科技開發(fā)有限公司；纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶和木聚糖酶 天津市諾奧科技公司；酒石酸、檸檬酸均為食品級。

1.2 儀器與設備

pH計 上海偉業(yè)儀器廠；生化培養(yǎng)箱 上海博迅公司；生物顯微鏡 重慶奧特公司；真空干燥箱 上海精宏公司；箱式電阻爐 天津市泰斯特公司；自動凱氏定氮儀 上海纖檢公司；紫外-可見分光光度計 北京瑞利公司。

1.3 方法

1.3.1 復合酶體系中各種酶制劑的配比試驗

破壁條件：pH4.0、溫度45℃、料水比1:9、酶解時間12h。

1.3.1.1 纖維素酶加入量對花粉破壁率的影響

研究不同纖維素酶加入量(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)對花粉破壁率的影響。

1.3.1.2 果膠酶加入量對花粉破壁率的影響

在確定最佳纖維素酶加入量的基礎上，研究不同果膠酶加入量(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)對花粉破壁率的影響。

1.3.1.3 木聚糖酶加入量對花粉破壁率的影響

確定最佳纖維素酶和果膠酶加入量的基礎上，研究不同木聚糖酶加入量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)對花粉破壁率的影響。

1.3.1.4 木瓜蛋白酶加入量對花粉破壁率的影響

確定最佳纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶加入量的基礎上，研究不同木瓜蛋白酶加入量(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)對花粉破壁率的影響。

1.3.2 復合酶破壁的單因素試驗

1.3.2.1 酶解pH值對花粉破壁率的影響

酶解pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，條件為復合酶加入量12‰，料水比1:9，45℃條件下酶解時間6h。比較不同pH值條件下的花粉破壁率。

1.3.2.2 復合酶加入量對花粉破壁率的影響

復合酶加入量分別為0.4‰、2‰、4‰、8‰、12‰、16‰，條件為pH4.5、料水比1:9、45℃條件下酶解時間6h。

1.3.2.3 酶解溫度對花粉破壁率的影響

酶解溫度分別為35、40、45、50、55℃，條件為pH4.5，復合酶加入量12‰，料水比1:9，酶解時間6h。

1.3.2.4 料水比對花粉破壁率的影響

料水比分別為1:6、1:9、1:12、1:15，條件為pH4.5，復合酶加入量12‰，在45℃條件下酶解時間6h。

1.3.2.5 酶解時間對花粉破壁率的影響

酶解時間分別為4、6、8、10、12h；條件為pH4.5，復合酶加入量12‰，料水比1:9，酶解溫度45℃。

1.3.3 二次回歸正交旋轉組合設計試驗

在上述單因素試驗的基礎上，選出五因素(酶解pH值、復合酶加入量、酶解溫度、料水比、酶解時間)中的主要因素，進行二次回歸正交旋轉組合設計試驗重點研究，以花粉破壁率為指標，優(yōu)化蓮花蜂花粉破壁工藝參數(shù)[19]。

1.3.4 破壁率測定

取蓮花蜂花粉樣品1g，加蒸餾水10mL，制成10%的花粉液，制作玻片，置于顯微鏡下觀察。制作3個玻片，每片5個視野，統(tǒng)計計算破壁率。

1.3.5 理化指標測定

單一花粉率測定：計數(shù)法，參考GH/T 1014—1999《蜂花粉》；水分測定：真空干燥法，參考GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；灰分測定：高溫燃燒法，參考GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；蛋白質測定：凱氏定氮法，參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》；還原糖測定：直接滴定法，參考GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》；VC測定：2,4-二硝基苯肼法，參考GB/T 5009.86—2003《蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定》。1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用DPS軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，以P＜0.05為顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 蓮花蜂花粉破壁前后的特征

在10×10顯微鏡下觀察蓮花蜂花粉破壁前后的細胞圖，見圖1。

圖1 破壁前(A)和破壁后(B)的蓮花蜂花粉Fig.1 Microscopic observation of intact (A) and disrupted (B) lotus bee pollen cells

2.2 復合酶體系中各種酶制劑的配比試驗

2.2.1 纖維素酶加入量對花粉破壁率的影響

圖2 纖維素酶加入量對花粉破壁率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis with different dosages of cellulase alone on the disruption of lotus bee pollen cell walls

纖維素酶能消解花粉壁內壁的纖維素，花粉壁破裂并促使內容物溢出，所以其加入量對蓮花花粉破壁影響很大，破壁率隨著纖維素酶加入量的增大而顯著升高。由圖2可知，隨著纖維素酶的增加，蓮花蜂花粉的破壁率逐漸增加，當纖維素酶加入量為0.8%和1.0%時，花粉破壁率提升很小，選擇0.8%為纖維素酶最適加量。

2.2.2 果膠酶加入量對花粉破壁率的影響

圖3 果膠酶加入量對花粉破壁率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis with 0.8% celluase and different dosages of pectinase on the disruption of lotus bee pollen cell walls

果膠酶同樣可以分解劃分內壁的果膠質，促使花粉破壁。由圖3可知，纖維素酶最適量0.8%，果膠酶加入量對蓮花花粉破壁率具有顯著作用。當果膠酶加入量為0.4%時，花粉破壁率達到最高，0.4%為果膠酶最適加入量。

2.2.3 木聚糖酶加入量對花粉破壁率的影響

圖4 木聚糖酶加入量對花粉破壁率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis with 0.8% celluase, 0.4% pectinase and different dosages of xylanase on the disruption of lotus bee pollen cell walls

木聚糖酶可以分解花粉的細胞壁以及β-葡聚糖，降低物料的粘度，促進有效物質的釋放，并能降低其中的非淀粉多糖，促進營養(yǎng)物質的吸收利用，因而更易取得可溶性脂類成分。由圖4可知，添加纖維素酶0.8%和果膠酶0.4%，在木聚糖酶加入量為0.1%～0.2%時，蓮花花粉的破壁率提高明顯；而加入量大于0.2%后，花粉破壁率基本不變，選擇0.2%為木聚糖酶的最適加入量。

2.2.4 木瓜蛋白酶加入量對花粉破壁率的影響

圖5 木瓜蛋白酶加入量對花粉破壁率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis with 0.8% celluase, 0.4% pectinase, 0.2% xylanase and different dosages of papain on the disruption of lotus bee pollen cell walls

木瓜蛋白酶是一種含疏基(—SH)肽鏈內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的水解能力，同時，還具有合成功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質。木瓜蛋白酶的添加，可使花粉內壁蛋白質得以分解，促使花粉破壁。由圖5可知，分別加纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶最適量0.8%、0.4%和0.2%時，蓮花花粉破壁率受木瓜蛋白酶影響顯著。當木瓜蛋白加入量為0.6%時，花粉破壁率最大。因此選擇0.6%作為木瓜蛋白酶的最適加入量。

4種酶制劑的最適加入量配比為纖維素酶(0.8%):果膠酶(0.4%):木聚糖酶(0.2%):木瓜蛋白酶(0.6%)＝4:2:1:3。

2.3 蓮花蜂花粉破壁單因素試驗結果

2.3.1 酶解pH值對花粉破壁率的影響

圖6 酶解pH值對花粉破壁率的影響Fig.6 Effect of hydrolysis pH on the disruption of lotus bee pollen cell walls

由圖6可知，試驗條件下pH3.5～4.5時，花粉的破壁率上升；當pH4.5～5.0時，破壁率下降。顯然，pH4.5時，花粉破壁率最高[20]，pH4.5是復合酶破壁的最適pH值。

2.3.2 復合酶加入量對花粉破壁率的影響

圖7 復合酶加入量對花粉破壁率的影響Fig.7 Effect of total enzyme dosage on the disruption of lotus bee pollen cell walls

由圖7可知，當復合酶加入量在0.4‰～12‰時，破壁率上升得快；而當加酶量為12‰～15‰時，破壁率基本趨于平衡。選擇12‰為復合酶的最適加入量。

2.3.3 酶解溫度對花粉破壁率的影響

圖8 酶解溫度對花粉破壁率的影響Fig.8 Effect of hydrolysis temperature on the disruption of lotus bee pollen cell walls

由圖8可知，溫度對花粉破壁率的作用很顯著，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在45℃時，花粉的破壁率最高。

2.3.4 料水比對花粉破壁率的影響

圖9 料水比對花粉破壁率的影響Fig.9 Effect of material-to-water ratio on the disruption of lotus bee pollen cell walls

由圖9可知，1:9為最合適的料水比。

2.3.5 酶解時間對花粉破壁率的影響

圖10 酶解時間對花粉破壁率的影響Fig.10 Effect of hydrolysis time on the disruption of lotus bee pollen cell walls

由圖10可知，當酶解時間6h時，花粉已達到最大破壁率，過長時間對劃分的破壁率沒有影響。

根據(jù)酶解pH值、復合酶加入量、酶解溫度、料水比和酶解時間對花粉破壁率的作用，試驗選用酶解pH值、復合酶加入量、酶解溫度、料水比為研究因素進行正交試驗，以得到最佳酶解破壁條件。

2.4 二次回歸正交旋轉組合設計試驗結果及其數(shù)學模型分析

依據(jù)單因素試驗結果，確定因素編碼水平范圍，采用二次回歸正交旋轉組合設計，以破壁率為指標，取酶解pH值、復合酶加入量、酶解溫度、料水比作為考察因素，共進行23次試驗，因素編碼見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Variables and their coded levels for quadratic orthogonal rotation combination design

2.4.1 數(shù)學模型的建立

表2 二次回歸正交旋轉組合設計試驗方案與結果Table 2 Quadratic orthogonal rotation combination design and corresponding experimental results

續(xù)表2

根據(jù)表2結果得到如下回歸方程：

2.4.2 二次回歸模型的顯著性檢驗

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance for the experimental results of quadratic orthogonal rotation combination design

由表3可知，失擬項F1＝ 2.808＜F0.05(2,6)＝10.92，說明失擬不顯著?；貧w方程的顯著性檢驗F2＝646.182＞ F0.01(14,8)＝5.56，說明回歸是顯著的。由此可認為上面給出的二次回歸方程模型是可行的。

2.4.3 重建二次回歸模型

根據(jù)表3，剔除回歸方程中不顯著項，得到簡化后的回歸方程：

各個因素對破壁率效果影響大小順序為酶解溫度(X3)＞酶解pH值(X1)＞復合酶加入量(X2)＞料水比(X4)。破壁率與酶解pH值、復合酶加入量、酶解溫度和料水比相關指數(shù)R2＝99.91%，表明該數(shù)學模型4個因素對產量的影響占99.91%，而其他因素的影響很小。

2.5 酶解破壁工藝優(yōu)化及驗證實驗

由簡化的回歸方程預測可得，最優(yōu)水平各個因素組合為：當X1的編碼水平為－1，X2的編碼水平為0，X3的編碼水平為0，X4的編碼為1.682時，Ymax=89.21。即酶解pH4.0、復合酶加入量12‰、酶解溫度45℃、料水比1:14時，蓮花蜂花粉破壁率最高為89.21%。選取最優(yōu)組合水平進行了3次重復，進行驗證實驗，結果見表4。

表4 驗證實驗結果Table 4 Validation of optimal hydrolysis conditions

3組重復實驗的實際破壁率與根據(jù)模型得到的結果誤差均小于5%，說明該模型能準確地反映花粉破壁的實際情況。

2.6 理化指標測定

表5 理化指標檢測結果Table 5 Physiochemical properties of intact and disrupted lotus bee pollen cells

由表5可知，對花粉破壁前后進行理化比較分析發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)物質含量都略微有增加，尤其是粗蛋白含量增加較大。所以，破壁有利于花粉的利用和深加工。

3 結 論

通過對4種酶制劑的單因素試驗和二次回歸正交旋轉組合設計試驗方法對酶解破壁條件進行優(yōu)化。最終確定蓮花花粉酶解破壁的最佳條件為酶解pH4.0、復合酶加入量12‰、酶解溫度45℃、料水比1:14，此條件下破壁率為89.21%，粗蛋白等營養(yǎng)物質都有所增加。

與其他破壁方法相比，酶解破壁具有專一性、反應條件溫和、利于保存花粉中的營養(yǎng)活性物質等優(yōu)點；并且具有高效，破壁效果好，作用穩(wěn)定的特點，有利于實現(xiàn)花粉破壁的產業(yè)化、標準化生產。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions for Disruption of Lotus Bee Pollen Cell Walls

YANG Wen-chao，CHEN Hu-nan，MIAO Xiao-qing*
(College of Bee Science, Fujian Agricultural and Foresty University, Fuzhou 350002, China)

The purpose of the present study was to develop a method to disrupt lotus bee pollen cell walls by one-step multienzymatic hydrolysis. Preliminary experiments were designed to investigate the effect of hydrolysis with different dosages of cellulase alone, 0.8% celluase and different dosages of pectinase, 0.8% celluase, 0.4% pectinase and different dosages of xylanase, or 0.8% celluase, 0.4% pectinase, 0.2% xylanase and different dosages of papain on the disruption of lotus bee pollen cell walls. We found that a mixture of cellulase, pectinase, xylanase and papain at a ratio of 4:2:1:3 was the best enzyme for the disruption of lotus bee pollen cell walls. Further, four hydrolysis parameters including pH, total enzyme dosage, temperature and material-to-water ratio for disrupting lotus bee pollen cell walls with this mixture of enzymes were optimized employing quadratic orthogonal rotation combination design. A mathematical model describing cell disruption percentage as a function of these four parameters was established. The optimal enzymatic hydrolysis parameters were found as pH 4.0, 12‰ of total enzyme dosage, 45 ℃ of hydrolysis temperature, and 1:14 (g/mL) of material-to-water ratio, resulting in a cell disruption percentage of 89.21%.

lotus bee pollen；enzymes；cell wall disruption

S896.4

A

1002-6630(2012)16-0012-06

2011-07-03

國家現(xiàn)代農業(yè)(蜂)產業(yè)技術體系項目(CARS-45-KXJ19)

楊文超(1980—)，男，講師，博士，研究方向為蜂產品加工與應用。E-mail：ywenchao13@163.com

*通信作者：繆曉青(1959—)，男，教授，研究方向為蜂產品加工與應用。E-mail：fjbees@126.com