趙 艷，楊發(fā)樹，張鳳枰，劉耀敏

(通威股份有限公司，四川 成都 610041)

反相高效液相色譜法測(cè)定巴沙魚中的黃體素和玉米黃質(zhì)

趙 艷，楊發(fā)樹，張鳳枰，劉耀敏

(通威股份有限公司，四川 成都 610041)

建立測(cè)定巴沙魚(Pangasius bocouti)中黃體素和玉米黃質(zhì)含量的反相高效液相色譜法，應(yīng)用C30柱，以乙腈-甲醇-三乙胺(75:25:0.05，V/V)和甲基叔丁基醚-三乙胺(100:0.05，V/V)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測(cè)器在450nm處進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：黃體素和玉米黃質(zhì)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.9999，加標(biāo)回收率分別為85.43%～96.60%和83.18%～96.18%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.01%～7.15%和4.60%～8.43%，檢出限分別為0.008mg/kg和0.003mg/kg。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于水產(chǎn)品中黃體素和玉米黃質(zhì)含量的檢測(cè)。關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜法；黃體素；玉米黃質(zhì)；巴沙魚

類胡蘿卜素是胡蘿卜素和葉黃素兩大類色素的總稱，為一類脂溶性化合物，水產(chǎn)動(dòng)物呈色主要是由葉黃素類色素決定，包括黃體素、玉米黃質(zhì)、角黃素、蝦青素等[1]。類胡蘿卜素在水產(chǎn)動(dòng)物中的主要生理功能包括：著色、抗紫外輻射的光保護(hù)作用、作為VA的前體物質(zhì)、增強(qiáng)對(duì)高氨和低氧的耐受性、抗氧化劑和脂質(zhì)過氧化的抑制劑等。研究表明，黃體素和玉米黃質(zhì)具有區(qū)別于其他類胡蘿卜素的特殊作用，在保護(hù)視力[3-4]、預(yù)防心血管疾病[5]和癌癥[6]以及增強(qiáng)免疫力[2,5]方面具有獨(dú)特的生理功能。因此，二者被認(rèn)為是重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。目前對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物中葉黃素類色素含量多采用分光光度法[7-9]、薄層色譜法[10]進(jìn)行分析，存在著操作過程復(fù)雜、靈敏度和準(zhǔn)確性差等問題，而高效液相色譜法則以其快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，逐步被廣泛應(yīng)用于類胡蘿卜素的分析中[11-13]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)巴沙魚中的黃體素和玉米黃質(zhì)進(jìn)行了分離檢測(cè)，旨在建立水產(chǎn)品中葉黃素類色素的測(cè)定方法，為水產(chǎn)動(dòng)物呈色原因提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

不同飼料喂養(yǎng)的巴沙魚，取巴沙魚背部肌肉測(cè)定，送檢樣品。

Alliance 2695高效液相色譜儀(2487紫外檢測(cè)器，ENPOWER色譜管理系統(tǒng)) 美國(guó)Waters公司；MTN-2800氮吹儀 天津奧特賽恩斯公司；T10 均質(zhì)器 德國(guó)IKA 公司； R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士B..chi公司；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CP224S 電子分析天平 德國(guó)Sartorius公司。

黃體素(95.8%)、玉米黃質(zhì)(99.8%) 美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(色譜純) 美國(guó)Fisher公司；三乙胺、石油醚(沸程30～60℃)、無水乙醇、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)、抗壞血酸(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；水為Milli-Q Gradient超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和提取溶液的配制

黃體素和玉米黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用少量丙酮溶解，再用甲醇為溶劑配成質(zhì)量濃度分別為100μg/mL和40μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液?？筛鶕?jù)需要稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

抗壞血酸乙醇溶液5g/L：取0.5g抗壞血酸結(jié)晶純品溶解于少量蒸餾水中，用乙醇稀釋至100mL，臨用前配制。

1.3 HPLC分析條件

色譜柱：Ultimate XB-C30色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)為450nm；進(jìn)樣體積：20μL。流動(dòng)相A：乙腈-甲醇-三乙胺(75:25:0.05，V/V)，流動(dòng)相B：甲基叔丁基醚-三乙胺(100:0.05，V/V)；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.4 供試樣品溶液的制備

1.4.1 皂化

樣品用絞肉機(jī)絞碎后稱取5g，準(zhǔn)確至0.0001g，置于250mL圓底燒瓶中，加50mL抗壞血酸乙醇溶液，用均質(zhì)器均質(zhì)使試樣完全分散，通入氮?dú)?，?0mL 500g/L氫氧化鉀溶液，混合均勻，置于60℃水浴回流40min，不時(shí)振蕩防止試樣粘附在瓶壁上，皂化結(jié)束，分別用5mL乙醇，5mL水自冷凝管頂端沖洗其內(nèi)部，取出燒瓶冷卻至約40℃。

1.4.2 提取

定量轉(zhuǎn)移全部皂化液于盛有60mL石油醚的500mL分液漏斗中，用30～50mL蒸餾水分2～3次沖洗圓底燒瓶并入分液漏斗，激烈振蕩2min、放氣，隨后混合、靜置分層。轉(zhuǎn)移水相于第2個(gè)分液漏斗中，分次用40mL石油醚重復(fù)提取兩次，棄去水相，合并3次石油醚相。每次用60mL蒸餾水洗滌石油醚提取液2～3次至中性，初次水洗時(shí)輕輕旋搖，防止乳化。石油醚提取液通過無水硫酸鈉脫水，后轉(zhuǎn)移到250mL雞心瓶中，加100mg BHT使之溶解。以上操作均在避光通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行。

1.4.3 濃縮

將石油醚提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在部分真空、水浴溫度40℃條件蒸發(fā)干。殘?jiān)?mL甲醇溶解，0.22μm濾膜過濾，待高效液相色譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

本研究采用皂化提取方法，固定皂化時(shí)間30min，考察不同皂化溫度(30、50、60、80℃和100℃)對(duì)黃體素和玉米黃質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果的影響(圖1)；固定皂化溫度為60℃，考察不同皂化時(shí)間(10、20、30、40min和60min)對(duì)其測(cè)定結(jié)果的影響(圖2)。

圖1 不同皂化溫度黃體素和玉米黃質(zhì)的含量變化曲線Fig.1 Change curves of measured lutein and zeaxanthin contents with saponification temperature

圖2 不同皂化時(shí)間黃體素和玉米黃質(zhì)的含量變化曲線Fig.2 Change curves of measured lutein and zeaxanthin with saponification time

由圖1可知，隨著溫度升高，葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量逐漸升高，但當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，黃體素和玉米黃質(zhì)含量變化不大，而溫度較高時(shí)乙醇容易揮發(fā)并且測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性較差，可確定最佳反應(yīng)溫度為60℃。由圖2可知，隨著皂化時(shí)間的延長(zhǎng)，黃體素和玉米黃質(zhì)含量逐漸升高，但在40min后黃體素和玉米黃質(zhì)含量變化不是非常明顯，可確定最佳皂化時(shí)間為40min。

2.2 高效液相色譜分析條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

黃體素和玉米黃質(zhì)互為同分異構(gòu)體，化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似，僅有1個(gè)末端基團(tuán)中的共軛烯炔鍵的位置不同，黃體素為β,ε-胡蘿卜素-3,3-二醇，而玉米黃質(zhì)為β, β-胡蘿卜素-3,3-二醇。由于二者在分子質(zhì)量、化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，通常很難將二者分離開。本實(shí)驗(yàn)采用Waters 2695高效液相色譜儀，比較C18柱、串聯(lián)兩根C18柱和C30柱對(duì)黃體素和玉米黃質(zhì)的分離效果，發(fā)現(xiàn)C18柱、串聯(lián)兩根C18柱都不能很好的分離兩者，而用使用分離類胡蘿卜素專一性的C30柱取得了良好的分離效果。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

用乙腈或甲醇作為流動(dòng)相，不能有效分離黃體素和玉米黃質(zhì)，而用乙腈-甲醇-甲基叔丁基醚作為流動(dòng)相則峰拖尾，加入0.05%的三乙胺峰形得到改善，本實(shí)驗(yàn)在所選擇的條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的分離效果分別見圖3～5。

圖3 黃體素和玉米黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed lutein and zeaxanthin standards

圖4 空白樣品的色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of blank sample

圖5 巴沙魚樣中黃體素和玉米黃質(zhì)色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of lutein and zeaxanthin in Pangasius bocouti

2.3 線性關(guān)系及檢出限的考察

取黃體素標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.04、0.2、1、4、10、20μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；玉米黃質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液為0.02、0.1、0.5、2、5、10μg/mL。按照上述色譜條件進(jìn)樣，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比計(jì)算檢出限，以10倍信噪比計(jì)算定量限。線性方程、檢出限和定量限見表2。

表2 黃體素和玉米黃質(zhì)的回歸方程、檢出限和定量限Table 2 Linear regression equations, LODs and LOQs of lutein and zeaxanthin

2.4 方法的精密度、穩(wěn)定性和回收率實(shí)驗(yàn)

取6份同樣的實(shí)際樣品按照1.4節(jié)供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，按照1.3節(jié)儀器條件進(jìn)行測(cè)定，黃體素和玉米黃質(zhì)的色譜峰的保留時(shí)間RSD分別為0.04%和0.06%，峰面積RSD分別為2.88%和2.71%，說明本方法精密度良好。

取黃體素(4g/mL)和玉米黃質(zhì)(2g/mL)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在室溫下避光放置1、6、24、48、72h后進(jìn)樣，黃體素和玉米黃質(zhì)的峰面積的日間RSD分別為4.17%和3.43%。表明72h內(nèi)黃體素和玉米黃質(zhì)的穩(wěn)定性較好，但為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，樣品制備后應(yīng)立即上機(jī)測(cè)定。

為了研究方法的可靠性，分別添加3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每水平6個(gè)平行樣，按照1.4節(jié)供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，按照1.3節(jié)條件進(jìn)行測(cè)定，平均回收率結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，黃體素和玉米黃質(zhì)的加標(biāo)回收率分別為85.43%～96.60%和83.18%～96.18%，RSD分別為5.01%～7.15%和4.60%～8.43%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

表3 黃體素和玉米黃質(zhì)的回收率和測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spike recovery rates of lutein and zeaxanthin and relative standard deviations of six replicate determinations (n=6)

2.5 巴沙魚樣品的測(cè)定

按照上述方法對(duì)巴沙魚實(shí)際樣品進(jìn)行定性與定量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 樣品的定量分析結(jié)果(n=3)Table 4 Lutein and zeaxanthin contents in Pangasius bocouti determined by this method (n=3)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)皂化時(shí)間、皂化溫度等前處理?xiàng)l件和色譜條件的優(yōu)化，采用高效液相色譜法測(cè)定巴沙魚中黃體素和玉米黃質(zhì)的含量。結(jié)果表明，方法靈敏度高、分離效果良好，為水產(chǎn)品中黃體素和玉米黃質(zhì)的測(cè)定提供了一種可靠的參考方法。

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Determination of Lutein and Zeaxanthin in Pangasius bocouti by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography

ZHAO Yan，YANG Fa-shu，ZHANG Feng-ping，LIU Yao-min
(Tongwei Co. Ltd., Chengdu 610041, China)

A high performance liquid chromatography method was established for the determination of 1utein and zeaxanthin in Pangasius bocouti. The chromatographic separation was achieved on a C30 column using a mobile phase made up of acetonitrile, methanol and spasmolytol (75:25:0.05, V/V) by gradient elution. The detection wavelength was set at 450 nm, and an external standard method was used to quantify 1utein and zeaxanthin. An excellent linear relationship of this method for 1utein and zeaxanthin was observed (R2＞0.999). The average spike recovery rates of 1utein and zeaxanthin were 85.43%－96.60% and 83.18%－96.18% with relative standard deviations of 5.01%－7.15% and 4.60%－8.43%. The limit of detection was 0.008 mg/kg for 1utein and 0.003 mg/kg for zeaxanthin. This method was sensitive, repeatable, and suitable for the determination of 1utein and zeaxanthin aquatic products.

reversed-phase high performance liquid chromatography；lutein；zeaxanthin；Pangasius bocouti

TS207.3

A

1002-6630(2012)16-0225-04

2011-07-14

趙艷(1983—)，女，工程師，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和食品及飼料產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)。E-mail：zhao518yan@126.com