唐姍，胡嶸，孫佳明，張輝

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117）

糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，臨床以高血糖、葡萄糖耐量減低及胰島素釋放異常為主要標(biāo)志。隨著2型糖尿病的藥物治療已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，α-葡萄糖苷酶抑制劑以其見(jiàn)效快且毒副作用小成為治療2型糖尿病的一類(lèi)新型藥物[1]。α-葡萄糖苷酶位于小腸刷狀緣膜上皮細(xì)胞，它能將雙糖，如蔗糖、麥芽糖等水解成可被小腸吸收的單糖，是食物中碳水化合物水解的關(guān)鍵酶。因此，抑制該酶活性能夠延緩碳水化合物在腸道的吸收，減少葡萄糖吸收入血，達(dá)到防治餐后高血糖癥和緩解高胰島素血癥的目的[2-3]。

參連湯出自 《萬(wàn)病回春》，由人參、黃連組成，有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱燥濕之功?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，人參黃連藥對(duì)能夠調(diào)節(jié)空腹血糖、血胰島素，改善胰島素抵抗，被廣泛地應(yīng)用于糖尿病的臨床治療[4]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較不同溶劑制備的參連湯樣品及其有效組分黃連總生物堿、人參總皂苷的不同比例配伍樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，對(duì)古方及有效組分配伍的降糖作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，為合理開(kāi)發(fā)古方參連湯提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品

人參、黃連藥材購(gòu)于長(zhǎng)春宏檢大藥房，均經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為正品；黃連總生物堿（實(shí)驗(yàn)室自制，已申請(qǐng)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?01110243033.5），經(jīng)紫外分光光度法，在波長(zhǎng)349 nm檢測(cè)總堿純度＞99%；人參總皂苷（宏久參業(yè)科技股份有限公司，純度＞75%）。

1.2 試劑與儀器

α-葡萄糖苷酶（美國(guó)Sigma公司）；葡萄糖測(cè)定試劑盒（上海榮盛生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為分析純。酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；96微孔板，各型號(hào)移液槍及槍頭等。

2 方法

2.1 有效組分黃連總生物堿、人參總皂苷配伍組合

如表1所示。

表1 黃連總生物堿、人參總皂苷配伍比例

2.2 參連湯樣品的制備

2.2.1 水煎煮樣品 取人參藥材粗粉10 g，黃連藥材粗粉20 g，加14倍量水煎煮3次，每次3.5 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓干燥得干膏，粉碎備用。

2.2.2 乙醇回流樣品 取人參藥材粗粉10 g，黃連藥材粗粉20 g，加20倍量85℃70%乙醇回流提取4次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓干燥得干膏，粉碎備用。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

根據(jù)已有方法[5]改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)共設(shè)陰性、空白、樣品3個(gè)組，每組平行3個(gè)孔，按表2加入各溶液，37℃溫育15 min，各孔加入180μL葡萄糖測(cè)定試劑，37℃溫育15 min，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。采用葡萄糖氧化酶法，以葡萄糖的生成量計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制活性，酶活性抑制率（%）＝（陰性-樣品）／（陰性-空白）×100%。樣品設(shè)定1，2，3，4，5 mg·mL-15個(gè)濃度，以抑制率為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制得到抑制率曲線，并計(jì)算相應(yīng)IC50值。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定加入溶液／μL

2.4 葡萄糖氧化酶抑制活性測(cè)定

按2.3項(xiàng)下方法測(cè)定配伍2組受試藥物對(duì)葡萄糖氧化酶抑制活性，實(shí)驗(yàn)共設(shè)陰性、空白、樣品3個(gè)組，每組平行3個(gè)孔，按表3加入各溶液，37℃溫育15 min，各孔加入180μL葡萄糖測(cè)定試劑，37℃溫育15 min，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。以葡萄糖的生成量計(jì)算葡萄糖氧化酶抑制活性，酶活性抑制率（%）＝（陰性-樣品）／（陰性-空白）×100%。樣品設(shè)定1，2，3，4，5 mg·mL-15個(gè)濃度，計(jì)算抑制率。

表3 葡萄糖氧化酶抑制活性測(cè)定加入溶液／μL

3 結(jié)果

3.1 不同樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性

按2.3項(xiàng)下對(duì)各組樣品進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果用±s表示，如表4所示。

表4 不同樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n＝3）

表4 不同樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n＝3）

注：*P＜0.01

組別 IC50／mg·mL-1配伍1組2.0952±0.1204配伍2組 1.2209±0.0828*配伍3組 2.3801±0.1487配伍4組 3.5346±0.1710配伍5組 3.5692±0.0894參連湯水煎煮組 2.7426±0.1324參連湯乙醇回流組2.1621±0.1718

在實(shí)驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)，參連湯與有效組分各配伍組對(duì)α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，尤其是黃連總生物堿與人參總皂苷配伍2組（8∶2）最佳，大于乙醇回流提取組和水煎煮提取組。

3.2 不同樣品的葡萄糖氧化酶抑制活性

按2.4項(xiàng)下對(duì)配伍2組樣品進(jìn)行葡萄糖氧化酶抑制活性測(cè)定，結(jié)果用±s表示，如表5所示。

表5 不同樣品的葡萄糖氧化酶抑制活性（±s，n＝3）

表5 不同樣品的葡萄糖氧化酶抑制活性（±s，n＝3）

注：表中-為負(fù)值，無(wú)意義

濃度／mg·mL-1 12 34 5抑制率／% （1.89±0.1264）（0.24±0.1703）---

從表5可知，配伍2組受試藥物對(duì)葡萄糖氧化酶幾乎沒(méi)有抑制作用，2.3項(xiàng)下建立的篩選模型可以避免藥物對(duì)葡萄糖氧化酶活性的影響，避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)。另外，2.3項(xiàng)下為7組樣品平行試驗(yàn)，即使存在對(duì)葡萄糖氧化酶抑制作用，也屬于系列誤差，對(duì)組間比較無(wú)明顯影響。

4 討論

本試驗(yàn)選擇了以直接水解物蔗糖為底物的篩選模型，具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）經(jīng)濟(jì)、快捷，篩選僅需微量樣品，靈敏度高，可進(jìn)行體外高通量篩選；（2）篩選得到的 α-GI（α-葡萄糖苷酶抑制劑）靶向作用具體，作用機(jī)制確切。（3）與PNPG底物篩選模型相比，假陽(yáng)性率較低，具有定向篩選的特點(diǎn)[1]。因此，選擇以蔗糖為底物的酶-抑制劑-96微孔板篩選模型是一種行之有效的α-GI篩選方法。

對(duì)不同提取方法制備的參連湯及其有效組分配伍組合的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)各組均具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性。從數(shù)據(jù)直觀分析，不同提取方法的參連湯樣品比較，乙醇回流提取的抑制活性高于水煎煮提取，說(shuō)明古方的傳統(tǒng)提取工藝有一定的限制性，未能將參連湯中α-GI充分煎出，而采用乙醇回流法提取，能夠提高α-GI的提取效率。

單用黃連總生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用強(qiáng)于單用人參總皂苷，當(dāng)二者配伍時(shí)，隨著黃連總生物堿比例的逐漸增大，抑制活性逐漸增強(qiáng)。尤其是配伍2組（黃連總生物堿與人參總皂苷8∶2）的IC50值最小，說(shuō)明黃連總生物堿在配伍樣品中可能起主導(dǎo)作用，而人參總皂苷為協(xié)同促進(jìn)作用。

在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的有效組分最優(yōu)配伍是黃連總生物堿與人參總皂苷8∶2，即4∶1。根據(jù)黃連中總生物堿含量約為8%[6]，人參中總皂苷含量約為4%[7]，折合成原藥材量比例為黃連-人參（2∶1），正與參連湯古方組成相吻合。而有效組分配伍時(shí)的抑制活性遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)古方藥材的提取樣品，說(shuō)明黃連總生物堿、人參總皂苷是參連湯中抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性部位。經(jīng)過(guò)現(xiàn)代工藝，將黃連、人參的有效組分進(jìn)行提取和配伍，形成復(fù)方組分中藥，既具有現(xiàn)代藥學(xué)的先進(jìn)性，又有中醫(yī)藥復(fù)方聯(lián)合用藥的傳統(tǒng)特點(diǎn)[8]。由于是由純度更高的有效組分提取物所組成，因而不僅能夠提高藥效，更重要的是便于進(jìn)行藥效作用機(jī)制、藥物代謝等深入的研究，進(jìn)而明確每個(gè)組分對(duì)參連湯功能主治所貢獻(xiàn)的藥效學(xué)作用及其作用機(jī)制，也可以進(jìn)一步闡明各個(gè)組分之間的相互作用的性質(zhì)[9]，進(jìn)一步為參連湯治療糖尿病做出貢獻(xiàn)。