殷秀梅，羅焜，劉美子，羅紅梅*

（1.瀕危藥材繁育國家工程實驗室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400716）

蛇床子為我國傳統(tǒng)中藥， 《中國藥典》記載其來源為傘形科植物蛇床Cnidiummonnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實，具有燥濕祛風(fēng)，殺蟲止癢，溫腎壯陽的功能，用于陰癢帶下，濕疹瘙癢，濕痹腰痛，腎虛陽痿，宮冷不孕等[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明蛇床子的藥理作用廣泛，有抗心律失常、降血壓、血脂、鎮(zhèn)靜催眠、治療骨質(zhì)疏松、抗菌、止癢、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[2-5]。藥用植物蛇床的近緣物種，主要包括同屬植物興安蛇床Cnidiumdauricum（Jacquin）Fischer ＆ C.A.Meyer，同科植物毒芹CicutavirosaLinn.、粗糙獨活HeracleumscabridumFranch.和旱芹ApiumgraveolensLinn.。這些近緣物種在外形上與藥用植物蛇床極為相似，但藥效卻完全不同。如毒芹，全草有毒，人畜誤食往往發(fā)生急性中毒或死亡。

DNA條形碼技術(shù)是利用基因組中一段公認標(biāo)準的、相對較短的DNA片段來進行物種鑒定的新方法。由加拿大分類學(xué)家Paul Hebert首次提出，隨后引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注[6-7]。ITS2作為DNA條形碼序列，因其兩端具有保守區(qū)便于通用引物設(shè)計，序列擴增容易，變異位點充足等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于動植物物種鑒定[8]。本研究選用ITS2序列對蛇床及其近緣物種進行鑒定研究，分析蛇床子基原植物與近緣物種之間的變異性，進化樹中物種的聚類情況，以及ITS2序列二級結(jié)構(gòu)的差異，以期建立蛇床及其近緣物種鑒定的新方法，確保臨床用藥安全。

1 材料與方法

1.1 材料

蛇床新鮮葉片采自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所廣西分所藥用植物園，標(biāo)本號PS1219MT01（GenBank登錄號JF421487）。蛇床子基原植物及近緣物種毒芹Cicutavirosa、旱芹Apiumgraveolens、粗糙獨活Heracleumscabridum、興安蛇床Cnidium dauricum的ITS2序列下載于GenBank數(shù)據(jù)庫，蛇床及其近緣物種信息見表1。

表1 蛇床及其近緣物種材料信息

1.2 樣品DNA提取、PCR擴增和測序

采用植物 DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取DNA。ITS2序列的PCR擴增及測定方法均參考Chen等的研究[8]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序獲得的峰圖利用CodonCode AlignerV3.7.1（CodonCode Co.，USA.）校對拼接以獲得可用于后續(xù)分析的ITS2序列。實驗數(shù)據(jù)與GenBank下載的ITS2序列均采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和26S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列[9]。通過MEGA5.0軟件對不同樣本進行序列對比和遺傳距離分析，并重構(gòu)其NJ系統(tǒng)發(fā)育樹?；赟chultz等[9]的研究預(yù)測各物種ITS2二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛇床種內(nèi)ITS2序列變異分析

蛇床的4條參考序列比對后長度為221 bp，GC含量范圍為57.5% ～57.9%，平均 GC含量為57.7%。含有1個POLY‘G’結(jié)構(gòu)（大于等于5個單堿基重復(fù)），變異位點4處，分別為19位點的AG變異，77，145位點的C-T變異和217位點的A-T變異。蛇床種內(nèi)平均K2P距離為0.0098，種內(nèi)最大K2P距離為0.018，種內(nèi)ITS2序列變異較小。

2.2 蛇床種間ITS2序列變異分析

蛇床與其近緣物種間序列進行比對后長度為230 bp，GC含量范圍為52.9%～57.9%，平均GC含量為56.4%。種間ITS2序列變異較大，ITS2序列間存在較多的變異位點（圖1）。蛇床種間平均K2P距離為0.2291，種間最小 K2P距離為 0.133，為蛇床（JF421487）和同屬植物興安蛇床（AY330508），見表2。

圖1 蛇床與近緣物種的種間ITS2序列比對

表2 蛇床種間K2P遺傳距離

2.3 聚類分析

從基于ITS2條形碼序列構(gòu)建的蛇床與其近緣物種的NJ樹（圖2）可以看出，蛇床不同來源的樣品聚為一支，后又與同屬植物興安蛇床Cnidium dauricum聚為一支。其近緣物種毒芹Cicutavirosa、粗糙獨活Heracleumscabridum、旱芹Apiumgraveolens均獨立為一支。從NJ樹圖可以看出蛇床能與其近緣物種明顯區(qū)分開。

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的蛇床與其近緣物種的NJ樹

2.4 蛇床及其近緣物種ITS2序列二級結(jié)構(gòu)比較

如圖3所示，蛇床與其近緣物種的ITS2二級結(jié)構(gòu)均有螺旋（Helix）Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，蛇床與其近緣物種在螺旋Ⅱ和螺旋Ⅳ上較為保守，在螺旋Ⅰ和螺旋Ⅲ上具有差異。結(jié)果顯示，ITS2二級結(jié)構(gòu)能有效的區(qū)分蛇床及其近緣物種。

圖3 蛇床與其近緣物種的ITS2二級結(jié)構(gòu)圖

3 討論

近年ITS2作為DNA條形碼序列在很多植物鑒定研究中取得良好效果。Chen[8]等對753屬4800種藻類、真菌和植物的6600條ITS2序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其種級水平鑒定效率達到92.7%。ITS2對于不同科屬如薔薇科、豆科、蕓香科、黃芪屬、重樓屬等都有較好的鑒定效果[10-14]。此外，ITS2在大青葉、黨參、京大戟等藥用植物的鑒定中，均能將基原植物及其近緣物種和混偽品區(qū)別開[15-19]。

蛇床及其各近緣物種ITS2序列長度范圍為221～229 bp，序列間存在較多的變異位點，無插入／缺失變異。蛇床種內(nèi)最大K2P距離0.018，種間最小K2P距離0.133，種間最小K2P距離遠大于蛇床種內(nèi)K2P距離。蛇床與其同屬植物興安蛇床的變異位點相對較少，親緣關(guān)系較近，而與同科近緣物種種間變異較大。通過NJ樹聚類分析及ITS2二級結(jié)構(gòu)比較，均能將蛇床與其近緣物種明確區(qū)分。本研究證實了ITS2序列鑒別蛇床與其近緣物種的可行性，同時為中藥材鑒別研究提供了新思路。