張愛平，蔡少麗，楊 鶴，鄭海英，柯崇榕，黃建忠

(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心生命科學(xué)學(xué)院福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，福建 福州 350108)

果膠酶(pectinases)是一類含多種酶的復(fù)合酶，可用于植物纖維中果膠質(zhì)(由D-半乳糖醛酸以α-1，4-糖苷鍵連接形成的直鏈狀的聚合物)的分解。已廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)工業(yè)加工過程中，如果膠提取、酒類澄清、咖啡和茶的發(fā)酵、油的提取、污染果膠的污水處理等［1-2］。果膠酶可按照作用底物(果膠酸、果膠酯和原果膠等)、作用方式(裂解和水解)、作用位點(diǎn)(內(nèi)切和外切)、作用適宜pH(酸性、中性和堿性)進(jìn)行分類。堿性果膠酯裂解酶(EC 4.2.2.2.)是指可在堿性條件下水解聚乳糖醛酸α-1，4-糖苷鍵并釋放出可溶性不飽和寡聚乳糖醛酸的一類堿性果膠酶，一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonate lyase，PGL)［3］。堿性果膠酶除廣泛應(yīng)用于食品(茶葉和咖啡發(fā)酵、榨油、誘導(dǎo)植物抗病的綠色食品生產(chǎn))、環(huán)境保護(hù)(廢水處理)、植物病毒純化、飼料添加劑、洗滌劑以及紙漿漂白等方面，已成為綿織物處理過程中至關(guān)重要的生物制劑［4-5］。與傳統(tǒng)的處理棉織纖維的工藝相比，在工藝上和處理效果上都有許多優(yōu)勢。堿性果膠酶主要來源于細(xì)菌，早期主要進(jìn)行野生菌種篩選及酶學(xué)特性方面的研究［6］，直至20世紀(jì)80年代后才漸漸有將其基因克隆進(jìn)行異源表達(dá)的研究，但都主要集中在大腸埃希菌中表達(dá)，產(chǎn)量低，并且需要昂貴的IPTG作為誘導(dǎo)劑，并不太可能用于工業(yè)化生產(chǎn)［7-8］。于是近年來越來越多將其異源表達(dá)的研究轉(zhuǎn)向了技術(shù)成熟并利于工業(yè)化生產(chǎn)的畢赤酵母。本研究通過蛋白質(zhì)工程手段構(gòu)建了以GAP為啟動子的堿性果膠酶基因工程菌GS115-pGAPZαA-PGL，實現(xiàn)其在畢赤酵母GS115中無需甲醇誘導(dǎo)的表達(dá)，在理論上進(jìn)一步完善了堿性果膠酯裂解酶在畢赤酵母中異源表達(dá)的研究，在實際應(yīng)用中可為其進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)和擴(kuò)大應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 畢赤酵母EIM-60、大腸埃希菌(E.coli)DH5α、巴斯德畢赤酵母菌株(P.pastoris)GS115、pGAPZαA質(zhì)粒由本實驗室保存。pMD18T載體購自TaKaRa公司。

1.1.2 酶和試劑 Extaq酶、rTaq酶、限制性內(nèi)切酶NotⅠ、KpnⅠ、AvrⅡ、T4DNA 連接酶均購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒、Agar A、Zeocin均購自上海生工;PGA(polygalacturonic acid)購自Sigma公司;其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純，引物由上海生工合成。

1.1.3 培養(yǎng)基(%) LB培養(yǎng)基:蛋白胨1，氯化鈉1，酵母浸出物0.5;低鹽LB培養(yǎng)基:蛋白胨1，氯化鈉0.5，酵母浸出物0.5;YPD培養(yǎng)基:酵母提取物1，胰蛋白胨2，葡萄糖2。

1.2 方法

1.2.1 PGL基因的獲得 根據(jù)實驗室已有的堿性果膠酶的序列設(shè)計引物:P1:5'-TTGCT GAT TTA GGC CAT CAA ACG-3';P2:5'-CGGTTA ATT TAA TTT ACC AGC ACC CG-3'，在P1前添加NotⅠ酶切位點(diǎn)，在P2前添加酶切位點(diǎn)KpnⅠ。用玻璃珠法從實驗室菌株畢赤酵母EIM-60中獲得酵母基因組 DNA［9］，后經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)獲得目的基因PGL。

1.2.2 畢赤酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后進(jìn)行NotⅠ、KpnⅠ雙酶切，與經(jīng)過相同雙酶切的pGAPZαA過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(E.coli)DH5α，得到重組質(zhì)粒pGAPZαA-PGL，經(jīng)AvrⅡ酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，涂布在含有100 μg/mL的Zeocin+篩選標(biāo)記的YPD平板上，28℃培養(yǎng)2～5 d至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.2.3 重組畢赤酵母工程菌株的篩選和鑒定重組畢赤酵母菌株的鑒定:采用煮-凍-煮法提取酵母基因組 DNA，以此為模板［10］，P1、P2 為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

1.2.4 重組畢赤酵母工程菌株的表達(dá) 挑取驗證成功的陽性克隆子于5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，28℃，230 r/min進(jìn)行一級培養(yǎng)至OD值2～6時取1 mL培養(yǎng)液，重懸于30 mL的YPD中，28℃，230 r/min 振蕩培養(yǎng) 6 d［11］，12000 r/min，5 min，收集上清，即為粗酶液。

1.2.5 重組畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的分析 ①SDSPAGE:取粗酶液80 μL，采用5%濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳，考馬斯亮藍(lán)G-250染色，進(jìn)行SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)情況;②酶活的測定:取粗酶稀釋液20 μL與2 mL的聚半乳糖醛酸混勻，45℃保溫15 min，加入3 mL磷酸溶液混勻終止其反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，選用1 cm石英比色皿在紫外分光光度計上讀取235 nm時的吸光值。1個標(biāo)準(zhǔn)酶活單位(U)定義為每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生1 μmol的不飽和聚半乳糖醛酸所需的酶量。酶活計算:

其中:EPGL為堿性果膠酸酯裂解酶酶活:μ/mL;A為235 nm處吸光度值;n為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母基因組的提取

根據(jù)玻璃珠法從實驗室菌株畢赤酵母EIM-60中獲得酵母基因組DNA。

2.2 PGL基因的克隆

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的PGL目的片段經(jīng)測序后為1206 bp，編碼402個氨基酸，相對分子質(zhì)量約43 ku，等電點(diǎn)為8.4。將PGL序列在NCBI上進(jìn)行 Blast分析，與枯草芽胞桿菌 B.sutbtilis X74800.1的同源性為100%。

2.3 pGAPZαA-PGL表達(dá)載體的構(gòu)建

純化回收的PGL基因經(jīng)NotⅠ、KpnⅠ雙酶切后，與經(jīng)過相同雙酶切的pGAPZαA過夜連接，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(E.coli)DH5α，經(jīng)篩選驗證后得到重組質(zhì)粒pGAPZαA-PGL，雙酶切和測序結(jié)果表明，插入片段在pGAPZαA中有正確的閱讀框。

圖3 pGAPZαA-PGL的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of pGAPZαA-PGL M:200 bp DNA marker;1、2:PGL gene

圖4 pGAPZαA-PGL雙酶切驗證Fig.4 Digestion identification of pGAPZαA-PGL M:200 bp DNA marker;1、2:pGAPZαA and PGL gene

2.4 GS115-pGAPZαA-PGL 的篩選和鑒定

pGAPZαA-PGL經(jīng)AvrⅡ酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至酵母GS115中，挑取Zeocin+抗性板上的單菌落于3 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，230 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，分別進(jìn)行菌液PCR鑒定及提取重組菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明，目的基因PGL已成功整合到畢赤酵母GS115中。

2.5 GS115-pGAPZαA-PGL表達(dá)產(chǎn)物的分析

銀染結(jié)果表明，重組PGL實現(xiàn)了在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，gel pro Analyser軟件分析其表達(dá)蛋白的表觀分子量約為44.3 ku(圖7)，通過考馬斯亮藍(lán)法蛋白濃度試劑盒測定其蛋白含量為0.430 g/L，通過BandScan軟件分析，目的蛋白占總蛋白的41.4%，即0.178 g/L;酶活測定為1750 U/L。

3 討論

畢赤酵母(Pichia pastoris)是近年來發(fā)展迅速的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有許多真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)［12］。已有眾多文獻(xiàn)報道果膠酶在畢赤酵母中的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，但是該表達(dá)均以AOX1為啟動子，表達(dá)需要以甲醇為誘導(dǎo)物［13-15］。雖然甲醇可嚴(yán)格調(diào)控和誘導(dǎo)AOX1基因的表達(dá)，但甲醇為有毒、易燃物質(zhì)，操作麻煩，不利于工業(yè)上尤其是食品及其相關(guān)領(lǐng)域的生產(chǎn)，因此為進(jìn)一步完善堿性果膠酯裂解酶基因(PGL)在畢赤酵母中的表達(dá)，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，本研究采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因為啟動子進(jìn)行PGL的表達(dá)。GAP啟動子具有很強(qiáng)的組成型表達(dá)能力，以葡萄糖、甘油等無毒物質(zhì)作為碳源，表達(dá)時無需更換碳源，發(fā)酵工藝更為簡單，更適合大規(guī)模的工業(yè)化培養(yǎng)［16］。

本研究將堿性果膠酯裂解酶PGL基因克隆到pGAPZαA中，通過蛋白質(zhì)工程手段成功實現(xiàn)該重組質(zhì)粒在畢赤酵母中的非甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)蛋白分子量為44.3 ku，發(fā)酵活力為1750 U/L，并不是很高，原因可能在于發(fā)酵條件未優(yōu)化;畢赤酵母對其所表達(dá)的蛋白進(jìn)行過度修飾;密碼子偏好性，從而限制其蛋白質(zhì)的翻譯速度;或者整合的拷貝數(shù)過多，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生后生調(diào)節(jié)，影響重組蛋白的產(chǎn)率等［17-18］。

本研究成功地使堿性果膠酯裂解酶在畢赤酵母中獲得了非甲醇誘導(dǎo)的表達(dá)，有一定的活性。酶活和表達(dá)量仍有很大的提升空間，今后可通過對其發(fā)酵條件優(yōu)化尋找合適的表達(dá)條件，并對重組酶產(chǎn)酶動力學(xué)和酶學(xué)性質(zhì)做詳細(xì)研究;再通過上罐擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)一步改造目的基因，密碼子優(yōu)化，定點(diǎn)突變，增加整合拷貝數(shù)等手段使其產(chǎn)量得到進(jìn)一步提升，以更好地應(yīng)用于工業(yè)上的生產(chǎn)。

［1］Hoondal G S，Tiwari R P，Tewari R，et al.Microbial alkaline pectinases and their industrial applications:a review［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2002，59:409-418.

［2］Alkorta Itziar，Garbisu Carlos，J Maria.，et al.Industrial applications of pectic enzymes:a review［J］.Process Biochemistry，1998，33:21-28.

［3］諸葛斌，堵國成，沈微，等.利用溫控載體構(gòu)建堿性果膠酯裂解酶工程菌［J］.微生物學(xué)報，2006，46(4):657-659.

［4］Zhang J，Henriksson G，Johansson G.Polygalacturonase is the key component in enzymatic retting of flax［J］.Journal of Biotechnology，2000，81(1):85-89.

［5］王蕓.重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的策略研究［D］.江南大學(xué)，2008.

［6］王傳槐，葉漢玲，王清.優(yōu)良堿性果膠酶產(chǎn)生菌篩選［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，18(4):51-56.

［7］Zhai Chao，Cao Junwei，Wang Youliang.Cloning and expression of a pectate lyase gene from Bacillus alcalophillus NTT33［J］.Enzyme and Microbial Technology，2003，33(2):173-178.

［8］肖靜，路福平，楊曉杰，等.Bacillus subtilis堿性果膠酶基因在大腸埃希菌中的克隆和表達(dá)［J］.高師理科學(xué)刊，2011，31(4):57-59.

［9］J薩姆布魯克，DW拉塞爾，黃培堂，等.分子克隆實驗指南(第3版)［M］.北京:科學(xué)出版社，2002.

［10］劇海，梁東春，郭剛，等.用于PCR實驗的畢赤酵母基因組DNA制備方法的比較［J］.天津醫(yī)藥，2003，31(5):270-272.

［11］劉德輝，何俊，林云熊，等.抗菌肽 LL-37在畢赤酵母SMD168中的高效表達(dá)及活性鑒定［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32(2):98-101.

［12］王蕓，華兆哲，劉立明，等.堿性果膠酶在重組畢赤酵母中高效表達(dá)的關(guān)鍵因素研究［J］.微生物學(xué)通報，2008，35(3):341-345.

［13］Zhuge Bin，Du Guo Cheng，Shen Wei，et al.Expression of a Bacillus subtilis pectate lyase gene in Pichia pastoris［J］.Biochemical Engineering Journal，2008，40(1):92-98.

［14］強(qiáng)慧妮，楊欣偉，田寶玉，等.黑曲霉果膠裂解酶基因在畢赤酵母Pichia pastoris GS115中的表達(dá)［J］.生物工程學(xué)報，2009，25(12):1962-1968.

［15］高秋芳，郭安平，孔華，等.果膠裂解酶、木聚糖酶及果膠裂解酶、木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，(8):1-5.

［16］鄒有土.擴(kuò)展青霉脂肪酶的異源表達(dá)及分子突變［D］.福建師范大學(xué)，2008.

［17］魏聯(lián)果.N-糖基化對在畢赤酵母中表達(dá)的瑞氏木霉外切纖維素酶酶活力的影響［D］.山東大學(xué)，2006.

［18］林國滟，蔡少麗，黃平，等.中性纖維素酶外切葡聚糖酶CBHⅡ的異源表達(dá)［J］.微生物學(xué)雜志，2011，31(6):88-91.