譚佩毅，黃秀錦

（江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223003）

Imoto比色法測定殼寡糖含量的研究

譚佩毅，黃秀錦

（江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223003）

從標(biāo)準(zhǔn)品的選擇、波長選定、試劑用量、比色條件、線性關(guān)系等方面研究了Imoto比色法測定殼寡糖含量的最佳條件。結(jié)果表明，測定波長為438nm，比色最佳條件為10g/L鐵氰化鉀3.5mL、0.5mol/L Na2CO33.5mL、水浴加熱時間85min、加熱溫度95℃；以氨基葡萄糖鹽酸鹽作為標(biāo)準(zhǔn)對照品，濃度在0～60μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。采用該比色法測得水解液中殼寡糖含量為39.77μg/mL，RSD值為2.15%。

殼寡糖，Imoto比色法，氨基葡萄糖鹽酸鹽

殼聚糖（Chitosan）是甲殼素部分脫乙?；蟮漠a(chǎn)物[1]，具有顯著的生物生理活性[2]和良好的功能性質(zhì)，已在食品、化妝品、生物制藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)以及廢水處理等領(lǐng)域中都得到了應(yīng)用[3]。但由于殼聚糖分子量較大，分子間及分子內(nèi)存在大量的氫鍵，使得殼聚糖分子結(jié)構(gòu)緊密，且只能溶解于稀乙酸等酸性溶液中形成透明狀的黏液[4-5]，因此殼聚糖在以上領(lǐng)域中的應(yīng)用很大程度上受到了限制。殼寡糖（chitooligosaccharides）又稱寡聚氨基葡糖，是殼聚糖降解后得到的由2～10個氨基葡糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的低聚糖[6]。殼寡糖是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基寡糖[7]，由于分子量和聚合度較低，溶解性和吸收率較好，易于被人體、動物及植物機(jī)體吸收利用[8]，因此，在保健品、營養(yǎng)劑、食品添加劑等方面都具有良好的應(yīng)用價值。殼寡糖來源廣泛，安全無毒，水溶性好，有多種生物活性，已引起國內(nèi)外醫(yī)藥研究者的廣泛關(guān)注。但測定殼寡糖含量的方法尚不成熟，目前基本采用測定D-氨基葡萄糖的方法間接測定殼寡糖含量，目前氨基葡萄糖常見的測定方法有Elson-Morgan法[9-10]、Imoto法[11-12]、苯酚-硫酸法[13]和3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）[14]。其中Elson-Morgan法操作繁瑣且回收率低，不適用于氨基糖與乙酰氨基糖混合的體系；苯酚-硫酸法顯色較淺，不適于氨基糖及乙酰氨基糖類物質(zhì)的測定；DNS法有較好的顯色效果，但此法的靈敏度略低[15]；Imoto法具有顯色效果較好，可用于測定氨基糖與乙酰氨基糖混合的體系，且靈敏度較高，穩(wěn)定性好，重復(fù)性好[16]。本實(shí)驗(yàn)分別從標(biāo)準(zhǔn)品的選擇、吸收波長的確定、試劑用量及線性關(guān)系等方面進(jìn)行考察，確定Imoto比色法測定殼寡糖含量的最佳條件，并通過重現(xiàn)性、回收率等實(shí)驗(yàn)對該方法進(jìn)行考察。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼寡糖（黃色粉末） 自制；葡萄糖、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽 Sigma公司；HCl、鐵氰化鉀、無水Na2CO3均為分析純。

TU-1900紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHA-C恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械廠；JA1003A電子精密天平 上海倫捷機(jī)電儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱取40℃真空干燥至恒重的葡萄糖、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品各100.00mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻即得1mg/mL對照品儲備液[17]。

1.2.1.2 10g/L鐵氰化鉀溶液的配制 準(zhǔn)確稱取1.00g鐵氰化鉀置于100mL棕色容量瓶中，去離子水定容，搖勻備用。

1.2.1.3 0.5mol/L Na2CO3溶液的配制 準(zhǔn)確稱取5.30g無水Na2CO3置于100mL容量瓶中，加入50mL溫水，攪拌溶解后冷卻至室溫，加水定容至100mL。

1.2.1.4 殼寡糖溶液的配制 準(zhǔn)確稱取1.00g殼寡糖置于100mL容量瓶中，用0.5mol/L乙酸溶液定容至100mL，振蕩溶解后備用。

1.2.2 殼寡糖水解液的制備 準(zhǔn)確量取殼寡糖溶液1mL置入小燒杯中，沿壁緩緩加入4mL 6mol/L HCl溶液，混合后置于沸水浴中水浴4h，流水冷卻后備用[5]。1.2.3 比色條件的確定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品及波長的選擇 分別量取葡萄糖、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液和殼寡糖水解液各1.0mL置于25mL比色管中，分別加入3mL鐵氰化鉀和3mL Na2CO3溶液，加水定容至25mL，具塞搖勻，用鋁箔封住比色管口，置于沸水浴中30min[12]，冷卻后以去離子水做基線，用紫外-可見分光光度計(jì)在300～800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到葡萄糖、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽經(jīng)褪色反應(yīng)后的吸收光譜，并與殼寡糖水解液經(jīng)褪色反應(yīng)后的吸收光譜進(jìn)行比較，以選擇最適標(biāo)準(zhǔn)品，同時確定最大吸收波長。

1.2.3.2 鐵氰化鉀溶液添加量的確定 取潔凈25mL比色管7支，分別加入殼寡糖水解液各1mL，再依次加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL鐵氰化鉀溶液，然后分別加入Na2CO3溶液5mL，按照1.2.3.1所示方法在最大吸收波長處測定吸光度值，考察鐵氰化鉀溶液添加量對褪色效果的影響。

1.2.3.3 Na2CO3溶液添加量的確定 取潔凈25mL比色管7支，分別加入殼寡糖水解液和鐵氰化鉀，再依次加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL Na2CO3溶液，按照1.2.3.1所示方法在最大吸收波長處測定吸光度值，考察Na2CO3溶液添加量對褪色效果的影響。

1.2.3.4 水浴加熱時間的確定 取潔凈25mL比色管10支，分別加入殼寡糖水解液、鐵氰化鉀和Na2CO3溶液，按照1.2.3.1所示方法分別置于沸水浴中加熱，每隔10min取出一管在最大吸收波長處測定吸光度值，考察加熱時間對褪色效果的影響。

1.2.3.5 水浴加熱溫度的確定 取潔凈25mL比色管6支，分別加入殼寡糖水解液、鐵氰化鉀和Na2CO3溶液，按照1.2.3.1操作后分別置于50、60、70、80、90、100℃水浴鍋中加熱，取出冷卻后在最大吸收波長處測定吸光度值，考察加熱溫度對褪色效果的影響。

1.2.3.6 正交實(shí)驗(yàn) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以鐵氰化鉀添加量、Na2CO3添加量、水浴加熱時間、水浴加熱溫度為考察因素，以吸光度值為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析各因素對吸光度的影響，以確定最佳比色條件，正交實(shí)驗(yàn)平行兩次。因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 依據(jù)1.2.3確定的各最適條件，分別吸取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mL 1.0mg/mL氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL容量瓶中，分別加入鐵氰化鉀和Na2CO3溶液，混勻，水浴加熱后，以去離子水做空白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 回收率實(shí)驗(yàn) 為考察方法的準(zhǔn)確度，采用加標(biāo)回收率法，向已知?dú)ぞ厶呛康臍す烟撬庖褐屑尤氩煌康臉?biāo)準(zhǔn)品，分別測定其殼聚糖含量，并計(jì)算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評價該比色方法的準(zhǔn)確度和可靠性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理分析方法 采用北京普析UVWin5 V 5.1.0進(jìn)行紫外掃描光譜圖圖繪制，采用Spss Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和Excel軟件對正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 比色條件的確定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及波長的選擇 Imoto法的原理是黃綠色鐵氰酸離子在堿性條件下能被還原糖還原成微黃色的亞鐵氰酸離子。若反應(yīng)中鐵氰化鉀過量，還原糖含量與生成的亞鐵氰化鉀的濃度呈正比關(guān)系，與反應(yīng)液的顏色成反比關(guān)系[11]。據(jù)文獻(xiàn)報道，各種還原糖和鐵氰化鉀反應(yīng)情況和最大吸收波長有所不同[18]，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)品和合適的最大吸收波長才能準(zhǔn)確測量出殼聚糖的含量。

由圖1可知，各標(biāo)準(zhǔn)品和殼寡糖水解液與鐵氰化鉀反應(yīng)后在420～450nm范圍內(nèi)有一最大吸收峰。這是因?yàn)槲舛戎饕蓺埩舻蔫F氰酸和生成的亞鐵氰化鉀產(chǎn)生，標(biāo)準(zhǔn)品和水解液發(fā)生反應(yīng)后都是以這兩種物質(zhì)為主，但各種標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長略有不同，這可能是因?yàn)楦鞣N標(biāo)準(zhǔn)品氧化后的產(chǎn)物有一定的吸光度，從而調(diào)高或降低了溶液的吸光度。各標(biāo)準(zhǔn)品中，氨基葡萄糖鹽酸鹽的最大吸收波長最大（438nm）、葡萄糖和氨基葡萄糖次之（435nm），乙酰氨基葡萄糖最大吸收波長最?。?25nm）。氨基葡萄糖鹽酸鹽和殼寡糖水解液均在438nm處吸收最強(qiáng)，這可能是因?yàn)闅す烟窃邴}酸作用下水解的產(chǎn)物以氨基葡萄糖鹽酸鹽為主，與氨基葡萄糖鹽酸鹽結(jié)構(gòu)最為相似，因此選擇以氨基葡萄糖鹽酸鹽為標(biāo)準(zhǔn)品，以438nm為最大吸收測定波長。

圖1 各標(biāo)準(zhǔn)品與殼寡糖水解液掃描光譜圖Fig.1 Scanning spectrums of 4 standard samples and hydrolysate

2.1.2 鐵氰化鉀溶液添加量的確定 通過添加0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL鐵氰化鉀溶液，分別考察對吸光度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 鐵氰化鉀溶液添加量對吸光度的影響Fig.2 Effect of addition of potassium ferricyanide reagent on absorbency

由圖2可知，隨著鐵氰化鉀溶液添加量的增加，溶液的吸光度值先緩慢增加，而當(dāng)溶液增加到4.0mL后，吸光度值呈線性增加趨勢。這主要是因?yàn)樯倭康蔫F氰化鉀加入后立即與溶液中的氨基葡萄糖鹽酸鹽反應(yīng)生成吸光度值較小的亞鐵氰化鉀和幾乎沒有吸光度值的氨基葡萄糖酸，而顏色較深吸光度值較大的鐵氰化鉀幾乎沒有殘留，因此吸光度值增加很小；隨著鐵氰化鉀添加量的不斷增加，溶液中幾乎所有的氨基葡萄糖鹽酸鹽都轉(zhuǎn)變?yōu)榘被咸烟撬?，且加入的鐵氰化鉀不與任何物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，此時溶液的吸光度隨著鐵氰化鉀的濃度增加而線性增加。但從反應(yīng)靈敏度和經(jīng)濟(jì)節(jié)約兩方面考慮，鐵氰化鉀溶液添加量以4.0mL較好。

2.1.3 Na2CO3溶液添加量的確定 由圖3可知，吸光度值隨著Na2CO3溶液添加量的增加先緩慢降低后迅速降低，當(dāng)達(dá)到最低點(diǎn)后又略有增加。這主要是因?yàn)殍F氰化鉀與氨基葡萄糖鹽酸鹽發(fā)生反應(yīng)需在堿性條件下才能順利進(jìn)行，只添加鐵氰化鉀，不添加Na2CO3溶液基本不會發(fā)生反應(yīng)，因此不添加Na2CO3時，溶液的顏色較深，吸光度值很大；隨著Na2CO3溶液添加量不斷增大，溶液pH逐漸增加，形成的堿性環(huán)境越來越適合鐵氰化鉀與氨基葡萄糖鹽酸鹽發(fā)生氧化還原反應(yīng)，溶液顏色褪去速度增加，吸光度值降低加快；但Na2CO3溶液添加量超過4.0mL時，溶液的pH過大，不適合氧化還原反應(yīng)，溶液顏色褪去較少。因此選擇Na2CO3溶液添加量為4.0mL較好。

圖3 Na2CO3溶液添加量對吸光度的影響Fig.3 Effect of addition of Na2CO3reagent on absorbency

2.1.4 水浴加熱時間的確定 鐵氰化鉀與氨基葡萄糖鹽酸鹽發(fā)生氧化還原反應(yīng)需要一個過程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入鐵氰化鉀和Na2CO3后進(jìn)行加熱，溶液顏色開始緩慢變淡，并隨加熱時間增加而逐漸褪色。

由圖4可知，在80min內(nèi)吸光度值基本以線性速度遞減，褪色反應(yīng)迅速，反應(yīng)液顏色逐漸變淺，這反映了鐵氰化鉀和氨基葡萄糖鹽酸鹽較容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而80min后吸光度值基本保持不變，表明褪色反應(yīng)基本完全。因此，選定水浴加熱時間為80min。

圖4 加熱時間對吸光度的影響Fig.4 Effect of bath time on absorbency

2.1.5 水浴加熱溫度的確定 溫度對顯色反應(yīng)有很大影響，溫度過低不利于氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行。由圖5可知，當(dāng)水浴溫度在60～70℃時，分子能量和運(yùn)動速度較慢，溶液褪色速度緩慢，吸光度值變化較小。隨著溫度升高，反應(yīng)速度加快，吸光度值逐漸變小，至90℃時達(dá)到最小值，而后當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，吸光度值略有增加。這可能是因?yàn)殚L時間的高溫加熱導(dǎo)致水蒸氣增加，溶液濃縮后，顏色亦會有所增加。因此為節(jié)省能源，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度，確定水浴加熱溫度為90℃。

圖5 水浴加熱溫度對吸光度的影響Fig.5 Effect of bath temperature on absorbency

2.1.6 最佳比色條件的確定 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇鐵氰化鉀添加量、Na2CO3添加量、水浴加熱時間、水浴加熱溫度為考察因素，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，采用Excel 2007對兩次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表2。利用Spss Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對正交實(shí)驗(yàn)兩次結(jié)果及平均值進(jìn)行方差分析，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 2 Orthogonal test results and range analysis

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

由表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中R值可以看出，各因素的影響次序?yàn)椋篋＞A＞C＞B，即加熱溫度對吸光度的影響最大，鐵氰化鉀添加量次之，Na2CO3添加量對吸光度的影響最小。本實(shí)驗(yàn)的最佳組合為A1B1C3D3，即最佳比色條件為：10g/L鐵氰化鉀溶液3.5mL、0.5mol/L Na2CO3溶液3.5mL、水浴加熱時間85min、水浴加熱溫度95℃。

由方差分析結(jié)果（表3）可知，誤差項(xiàng)的均方值僅為3.878×10-5，不足均方總和的萬分之一，且四因素對應(yīng)的Sig值均小于0.01，這說明誤差對吸光度的影響非常小，正交實(shí)驗(yàn)因素選擇正確。表3中四因素對應(yīng)的F值大小順序?yàn)镕D＞FA＞FC＞FB，說明四因素對吸光度的影響次序依次為D＞A＞C＞B，與正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果相一致。

2.1.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) A1B1C3D3的比色條件不在正交實(shí)驗(yàn)表中，因此按此比色條件做3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果分別為0.223、0.225、0.222，三數(shù)值及平均值（0.223）均小于正交實(shí)驗(yàn)最小值且穩(wěn)定，即在該條件下，溶液顏色變化最大，為比色的最優(yōu)條件。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)最佳比色條件，測定不同濃度氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品與鐵氰化鉀反應(yīng)后的吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖6）。

結(jié)果表明，在0～60μg/mL范圍內(nèi)，其線性回歸方程為y=-0.0137x+0.9288，相關(guān)系數(shù)R2=0.9990，結(jié)果符合朗伯比爾定律，表明線性關(guān)系良好。

圖6 氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of glucosamine hydrochloride

2.3 殼寡糖水解液中殼寡糖含量的測定

取殼寡糖水解液進(jìn)行比色測定（n=7），實(shí)驗(yàn)測得殼寡糖水解液中殼寡糖的平均含量為39.77μg/mL，RSD值為2.15%，表明該測定方法精密度較高，重復(fù)性好，能滿足實(shí)驗(yàn)樣品分析的需要。

3 結(jié)論

以氨基葡萄糖鹽酸鹽為標(biāo)準(zhǔn)對照品，采用Imoto比色法測定了殼寡糖水解液中殼寡糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氨基葡萄糖鹽酸鹽的最大吸收波長為438nm，且在0～60μg/mL范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系；最佳比色條件為：10g/L鐵氰化鉀溶液3.5mL、0.5mol/L Na2CO3溶液3.5mL、水浴加熱時間85min、水浴加熱溫度95℃。

采用Imoto比色法測得殼寡糖水解液中殼寡糖的含量為39.77μg/mL，RSD值為2.15%，表明該方法具有操作簡便、重現(xiàn)性好、回收率較高等優(yōu)點(diǎn)。

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Study on determination of total chitooligosaccharides by Imoto olorimetry

TAN Pei-yi，HUANG Xiu-jin
（Jiangsu Food Science College，Huai’an 223003，China）

A quantitative method for the determination of the total content of chitooligosaccharides was studied by Imoto colorimetry.The method was improved and verified in the aspects of standard sample，wavelength，reagent，colorimetric conditions.The result showed that the chitooligosaccharides content could be well calculated according to their absorption at 438nm by applying 10g/L potassium ferricyanide reagent 3.5mL and 0.5mol/L Na2CO33.5mL at 95℃ for 85min.The linear range of standard curve was 0～60μg/mL with glucosamine hydrochloride as standard.The content of chitooligosaccharides of hydrolysate by the method was 39.77μg/mL（RSD=2.15%）.

chitooligosaccharides；Imoto colorimetry；glucosamine hydrochloride

TS254.9

A

1002-0306（2012）22-0071-05

2012－05－10

譚佩毅（1967-），男，碩士，副教授，主要從事應(yīng)用化學(xué)研究。