龔一歌,周子琪,牛衛(wèi)芬

(山西醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院,晉中 030600)

百草枯,又名對草快、克蕪蹤,化學(xué)名稱為1,1-二甲基-4,4-聯(lián)吡啶陽離子鹽,因其對植物具有速效滅殺性,1962 年開始作為除草劑在全世界廣泛使用[1]。百草枯對土壤具有極強(qiáng)的吸附作用,易產(chǎn)生殘留污染,并且對人畜具有強(qiáng)大的毒性作用,無特效解毒劑[2]。我國早已在2014年7月1日起就停止了百草枯水劑的生產(chǎn),但保留母藥生產(chǎn)企業(yè)水劑的出口境外登記,允許專供出口生產(chǎn);2016年7月1日起停止了百草枯水劑在中國的銷售和使用[3];2020年9月26日起禁止百草枯可溶膠劑在中國境內(nèi)的銷售和使用[4]。盡管百草枯的使用受到了一定的限制,但是多年來世界各國均有關(guān)于百草枯中毒的報(bào)道事件,在我國農(nóng)村地區(qū)使用百草枯致經(jīng)濟(jì)作物大面積枯死及人畜中毒案件也時(shí)有發(fā)生。因此,建立百草枯高效、快速、靈敏、簡便的測定方法尤為重要。

目前,國內(nèi)外已報(bào)道的百草枯檢測方法有氣相色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、離子色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]和流動注射-化學(xué)發(fā)光法[10]等。與其他分析方法相比,流動注射-化學(xué)發(fā)光法具有靈敏度高、儀器設(shè)備簡便易行、分析快速等優(yōu)點(diǎn)。基于百草枯在堿性的魯米諾-鐵氰化鉀體系中具有較高化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的特點(diǎn),本工作提出了流動注射-化學(xué)發(fā)光法測定百草枯含量的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

BPCL-GP15-TIC型微弱發(fā)光測量儀;760CRT型紫外-可見分光光度計(jì);Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì);AR 2130型電子天平;Milli-QIntegral型超純水系統(tǒng)。

百草枯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:5.0 g·L-1,精確稱取0.250 0 g百草枯標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解,并定容至50 mL容量瓶中,于4 ℃冰箱中避光保存。使用時(shí),用水稀釋至所需質(zhì)量濃度。

魯米諾標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1.0×10-2mol·L-1,精確稱取0.885 8 g魯米諾標(biāo)準(zhǔn)品,用5 mL 1.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液溶解,再用水定容至500 mL容量瓶中,于室溫避光保存20 d后使用。使用時(shí),用水稀釋至所需濃度。

鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1.0×10-2mol·L-1,精確稱取0.329 2 g鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解,并定容至100 mL容量瓶中,室溫保存。使用時(shí),用水稀釋至所需濃度。

百草枯、魯米諾、鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于99%;試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

光電倍增管負(fù)高壓600 V;泵載流量4.0 mL·min-1。

1.3 試驗(yàn)方法

流動注射-化學(xué)發(fā)光法的流路示意圖見圖1。在500 mL 2.0×10-6mol·L-1魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入0.5 mL 5.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液,配制成含0.005 mol·L-1氫氧化鈉的2.0×10-6mol·L-1魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.0×10-3mol·L-1鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液與不同質(zhì)量濃度的百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液通過三通管混合,經(jīng)10 cm 長的混合管進(jìn)入流通池,待基線穩(wěn)定后,轉(zhuǎn)動進(jìn)樣閥,將上述含0.005 mol·L-1氫氧化鈉的2.0×10-6mol·L-1魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液載入鐵氰化鉀與百草枯的混合溶液中,三者發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng),記錄信號值。隨同做空白試驗(yàn)。

圖1 流動注射-化學(xué)發(fā)光法流路示意圖Fig.1 Schematic diagram of flow injectionchemiluminescence

2 結(jié)果與討論

2.1 混合管長度的選擇

按照試驗(yàn)方法對2.0×10-6mol·L-1魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液、1.0×10-3mol·L-1鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、1.0×10-6mol·L-1百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,考察了混合管長度(進(jìn)樣閥到流通池的距離)分別為5,10,15,20 cm 時(shí)對體系信噪比的影響。結(jié)果顯示:隨著混合管長度的增加,體系信噪比也隨之增加;當(dāng)混合管長度大于10 cm 后,體系信噪比略有降低。因此,試驗(yàn)選擇混合管的長度為10 cm。

2.2 化學(xué)發(fā)光體系的選擇

以魯米諾為化學(xué)發(fā)光試劑,考察了高錳酸鉀和鐵氰化鉀為催化劑時(shí)對體系信噪比的影響。結(jié)果顯示,以鐵氰化鉀為催化劑時(shí),體系信噪比更高,因此試驗(yàn)選擇的化學(xué)發(fā)光體系為魯米諾-鐵氰化鉀。

2.3 測定條件的選擇

2.3.1 試劑加入順序

試驗(yàn)考察了魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液、鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液和百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液的3種加入順序(①將鐵氰化鉀與百草枯先混合,然后將魯米諾載入上述混合溶液中;②將魯米諾與百草枯先混合,然后將鐵氰化鉀溶液載入上述混合溶液中;③將鐵氰化鉀與魯米諾先混合,然后將百草枯載入上述混合溶液中)對體系化學(xué)發(fā)光信號的影響。結(jié)果顯示,不同的加入順序?qū)w系化學(xué)發(fā)光信號有顯著影響,第①種加入順序較另兩種會產(chǎn)生更穩(wěn)定的信號,且信噪比更高。因此,試驗(yàn)選擇將鐵氰化鉀與百草枯先混合,然后再加入魯米諾。

2.3.2 魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液和氫氧化鈉的濃度

試驗(yàn)考察了魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為5.0×10-7,1.0×10-6,2.0×10-6,5.0×10-6,1.0×10-5,2.0×10-5,5.0×10-5,1.0×10-4,2.0×10-4mol·L-1時(shí)對體系信噪比的影響。結(jié)果顯示,與其他濃度相比,當(dāng)魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2.0×10-6mol·L-1時(shí),體系信噪比較高。

堿性條件下,魯米諾能被鐵氰化鉀氧化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。在500 mL 2.0×10-6mol·L-1魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液中 分別加 入0.1,0.2,0.5,1.0,1.5 mL 5.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液,考察了魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液中氫氧化鈉濃度分別 為0.001,0.002,0.005,0.010,0.015 mol·L-1時(shí)體系信噪比的變化情況。結(jié)果顯示,與其他濃度相比,當(dāng)氫氧化鈉濃度為0.005 mol·L-1時(shí),體系信噪比較高。因此,試驗(yàn)選擇魯米諾標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2.0×10-6mol·L-1,氫氧化鈉濃度為0.005 mol·L-1。

2.3.3 鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度

試驗(yàn)考察了鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為1.0×10-5,2.0×10-5,5.0×10-5,1.0×10-4,2.0×10-4,5.0×10-4,1.0×10-3,2.0×10-3mol·L-1時(shí)對體系信噪比的影響。結(jié)果顯示:體系信噪比隨鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的升高而增大;當(dāng)鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.0×10-3mol·L-1時(shí),體系信噪比較高。因此,試驗(yàn)選擇鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為1.0×10-3mol·L-1。

2.4 發(fā)光機(jī)理探討

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,鐵氰化鉀作為催化劑,可催化溶解氧氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光[11]。采用熒光分光光度計(jì)的生物發(fā)光模式對魯米諾-鐵氰化鉀和魯米諾-鐵氰化鉀-百草枯兩個(gè)體系的發(fā)射光譜進(jìn)行考察,結(jié)果如圖2(a)所示。

由圖2(a)可見,兩個(gè)體系的最大發(fā)射波長均為425 nm,說明兩個(gè)體系的發(fā)光體相同,均為魯米諾氧化產(chǎn)物3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)(3-AP*)[12-14]。接著,試驗(yàn)采用紫外-可見分光光度計(jì)考察了上述兩個(gè)體系的吸收光譜,結(jié)果如圖2(b)所示。

圖2 發(fā)射光譜和紫外-可見吸收光譜Fig.2 Emission spectra and UV-visible absorption spectra

由圖2(b)可見,百草枯的加入僅增強(qiáng)了魯米諾-鐵氰化鉀體系在300 nm 附近的吸收強(qiáng)度,而特征吸收峰的位置未發(fā)生變化,說明反應(yīng)產(chǎn)物并未改變。

基于以上試驗(yàn)結(jié)果,推測魯米諾-鐵氰化鉀-百草枯體系的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可能的機(jī)理是:在堿性條件下,鐵氰化鉀催化溶解氧氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,百草枯的加入使得發(fā)光體3-AP*濃度水平增大,從而發(fā)出更強(qiáng)的光。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

移取適量的百草枯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用水逐級稀釋,配制成百草枯質(zhì)量濃度為5.0×10-4,1.0×10-3,2.0×10-3,5.0×10-3,1.0×10-2,2.0×10-2,5.0×10-2,8.0×10-2,1.0×10-1g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照優(yōu)化的試驗(yàn)條件進(jìn)行檢測,以百草枯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(扣除空白)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,百草枯標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍分別為5.0×10-4～1.0×10-2g·L-1和2.0×10-2～1.0×10-1g·L-1,其對應(yīng)的線性回歸方程 分別為y＝11.64ρ＋17.02 和y＝123.6ρ＋1 493,相關(guān)系 數(shù)分別 為0.997 0 和0.998 8。

根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)對檢出限計(jì)算方法的規(guī)定,按照3sb/S(式中:sb代表空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差;S代表靈敏度,即低濃度水平線性范圍內(nèi)線性回歸方程的斜率)計(jì)算檢出限,結(jié)果為7.4×10-5g·L-1。

2.6 干擾試驗(yàn)

選取尿液中常見的物質(zhì),在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,對5.0×10-3g·L-1百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果顯示,在相對誤差的絕對值不超過5.0%時(shí),50倍的蔗糖、淀粉,8倍的葡萄糖,5倍的Ca2＋、Cl-,3 倍的Fe3＋,尿素、尿酸的質(zhì)量濃度不大于5.0×10-4g·L-1,Mg2＋、Cu2＋、SO42-的質(zhì)量濃度不大于1.5×10-4g·L-1對百草枯的測定結(jié)果沒有顯著影響。

2.7 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法分別對5.0×10-3g·L-1和5.0×10-2g·L-1百草枯 標(biāo)準(zhǔn)溶 液平行測定11次,計(jì)算得測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.6%和3.4%。

取3份5 mL 空白尿樣,分別加入一定量的百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液,以3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,取1 mL上清液于100 mL 容量瓶中,用水定容,按照儀器工作條件進(jìn)行測定,計(jì)算百草枯的回收率,結(jié)果見表1。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of test for recovery

本工作提出了流動注射-化學(xué)發(fā)光法測定百草枯含量的方法,該方法檢出限較低、線性范圍較寬,并且具有設(shè)備簡單、操作方便、靈敏度高、分析快速等優(yōu)勢,為實(shí)際樣品中百草枯的快速測定提供了一種新思路。