侯東軍，楊紅菊，于 雷，李 穎，王 海，姜艷彬

（中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125）

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法鑒定牛羊肉中的攙雜肉

侯東軍，楊紅菊，于 雷，李 穎，王 海，姜艷彬*

（中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125）

建立了一個(gè)鑒定牛羊肉中攙雜雜動(dòng)物肉的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。確定了一套可在牛羊肉中特異并靈敏地檢測(cè)出攙雜肉成分的引物對(duì)，以動(dòng)物細(xì)胞色素b基因組為模板可在恒溫63℃恒溫特異性擴(kuò)增出豬等基因片段而無(wú)其他擴(kuò)增片段影響?？蓹z測(cè)牛肉中0.01%～2%的豬肉成分。經(jīng)與PCR方法比對(duì)，結(jié)果表明，該方法可有效用于實(shí)際生鮮肉或加工肉制品樣本的鑒定。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增，真實(shí)性，鑒定

在國(guó)內(nèi)及國(guó)際貿(mào)易中牛、羊肉中攙雜價(jià)格便宜的豬肉，以次充好的欺騙行為屢見(jiàn)不鮮，在清真肉品種摻豬肉以代替牛羊肉更是嚴(yán)重冒犯了廣大具有伊斯蘭教信仰的消費(fèi)者，影響民族團(tuán)結(jié)，這些摻假行為極大損害了消費(fèi)者的利益。20世紀(jì)80年代，國(guó)外開(kāi)始對(duì)肉的種屬鑒定進(jìn)行研究，采用的方法主要有DNA雜交、免疫擴(kuò)散和等電點(diǎn)聚焦等。這些方法大都存在著成本高，工作量大，檢測(cè)對(duì)象要求高等缺點(diǎn)[1-2]。目前，針對(duì)摻假行為的檢測(cè)研究主要基于核酸擴(kuò)增的PCR方法，檢測(cè)速度快，靈敏和特異性強(qiáng)，但需要PCR儀才能擴(kuò)增，這就限制了該技術(shù)在條件有限的實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用和推廣[3-4]。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種相對(duì)于PCR技術(shù)較新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，特異性、靈敏度都較高，同時(shí)可進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，對(duì)設(shè)備要求低，有時(shí)僅用恒溫水浴鍋就可以完成檢測(cè)。線粒體中細(xì)胞色素b基因高度保守，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物成分鑒別的引物設(shè)計(jì)，本研究根據(jù)豬、牛等動(dòng)物細(xì)胞色素b的DNA序列設(shè)計(jì)并最后確定了引物，建立了環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法鑒定牛羊肉中攙雜肉的方法，探索了該方法在摻假鑒別行為中的可能性。研究中采用了市場(chǎng)上新出現(xiàn)的等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)，便于更直觀的反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)情況，該系統(tǒng)利用熒光染料不同于另外的濁度法恒溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉、牛肉、雞肉、鯉魚(yú)等動(dòng)物肉樣品 購(gòu)自北京市各大型超市；蛋白酶K、RNA酶、dNTP、10×PCR緩沖液（含Mg2+）、TaqDNA聚合酶、50bp ladder DNA marker等 均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Lamp恒溫?cái)U(kuò)增DNA試劑盒、Lamp恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒 日本榮研；等溫?cái)U(kuò)增mastermix 英國(guó)OPTIGENE。

PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像儀、電泳系統(tǒng) BIO-RAD；臺(tái)式離心機(jī) Sigma；等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng) 英國(guó)OPTIGENE。

1.2 LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成

從GenBank中下載豬、牛、羊、雞、魚(yú)的細(xì)胞色素b DNA序列，然后利用BLAST和CLUSTAL W程序進(jìn)行序列比對(duì)確定特異保守序列，運(yùn)行引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version 3.0（http：//primer explorer.jp/e/v3_manual/index.htmL）設(shè)計(jì)引物序列，用高壓滅菌后的超純水溶解，配制成100μmol/L的儲(chǔ)備液。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 DNA模板的提取

總DNA提取步驟如下：1.5mL離心管中加入約50mg樣品，加200μL TE溶（pH8.0），旋渦混勻，加入400μL裂解液，旋渦混勻；加600μL酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），劇烈振蕩，12000×g離心10min；取上清液，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），劇烈振蕩，12000×g離心10min；取上清液，加入等體積氯仿，劇烈振蕩，12000×g離心10min；取上清液，加0.8倍體積異丙醇，12000×g離心10min；取沉淀，70%乙醇清洗1次，室溫或50℃，20min晾干；加80μL TE（pH8.0）溶解。也可用等效動(dòng)物基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

1.4 Lamp反應(yīng)

配制25μL Lamp反應(yīng)體系，其中各成分含量為：反應(yīng)緩沖液15μL，引物4μL（40pmoL引物FIP，40pmoL引物BIP，5pmoL引物B3，5pmoL引物F3），5μL動(dòng)物基因組DNA，1μL無(wú)菌超純水，1μL Bst聚合酶，1μL熒光試劑，混勻快速離心，63℃恒溫?cái)U(kuò)增50min。用等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)觀察反應(yīng)并記錄結(jié)果。

1.5 特異性實(shí)驗(yàn)

分別提取豬肉、雞肉、鯉魚(yú)肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉中總DNA后，用所設(shè)計(jì)引物對(duì)上述各種DNA成分分別進(jìn)行Lamp反應(yīng)，比較引物特異性，從而選擇特異性引物。

1.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)

用研缽研磨制備豬肉、牛肉摻雜樣本，分別制備2%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%的豬肉的牛肉粉，按照上述方法提取DNA后進(jìn)行Lamp反應(yīng)并檢測(cè)。

1.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)從北京各大超市購(gòu)買銷售量較大的加工肉制品分別提取DNA進(jìn)行Lamp反應(yīng)，同時(shí)與PCR方法[5-6]進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性實(shí)驗(yàn)

用所設(shè)計(jì)引物對(duì)豬肉、雞肉、鯉魚(yú)肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉DNA成分分別進(jìn)行Lamp反應(yīng)，比較引物特異性，從而確定一套特異性引物，引物信息見(jiàn)表1。用該引物對(duì)這幾種動(dòng)物成分進(jìn)行Lamp反應(yīng)，熔解曲線見(jiàn)圖1，該引物對(duì)雞肉、鯉魚(yú)肉和豬肉成分均可產(chǎn)生熔解曲線，可擴(kuò)增出雞肉、鯉魚(yú)肉和豬肉成分，不能擴(kuò)增牛肉成分、綿羊成分和山羊成分，說(shuō)明該引物可用于牛、羊肉中雞肉、鯉魚(yú)肉和豬肉成分的摻雜鑒定。

圖1 引物特異性熔解曲線Fig.1 Primer specificity melted curve

2.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)

分別提取含有2%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%的豬肉粉的牛肉粉中動(dòng)物基因組DNA，然后分別進(jìn)行擴(kuò)增，Lamp擴(kuò)增曲線如圖2所示，可見(jiàn)隨著濃度的降低該擴(kuò)增曲線同DNA濃度梯度成一定的線性關(guān)系，但是隨著豬肉成分含量的降低，擴(kuò)增時(shí)間也逐漸增長(zhǎng)，當(dāng)牛肉粉中豬肉粉含量降至0.05%時(shí)，擴(kuò)增時(shí)間增長(zhǎng)至40min，0.01%時(shí)，也有明顯的擴(kuò)增曲線。G1樣本無(wú)相應(yīng)擴(kuò)增曲線，經(jīng)查實(shí)是由于實(shí)驗(yàn)失誤未加入相應(yīng)DNA而未發(fā)生擴(kuò)增。

圖2 不同濃度豬肉成分?jǐn)U增曲線Fig.2 Amplification curve of different pork content

2.3 實(shí)際樣本鑒定結(jié)果

從超市購(gòu)買銷售比例較大并標(biāo)明肉類成分的幾種肉制品用上述方法提取DNA并進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品都做了一個(gè)平行樣，并同時(shí)用PCR方法進(jìn)行比對(duì)，8個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果兩種方法一致率100%。結(jié)果表明該方法可以用于肉及肉制品中雞肉、魚(yú)肉、豬肉的摻假鑒別。注：“C+”表示擴(kuò)增出雞肉成分；“P+”表示擴(kuò)增出豬肉成分；“F+”表示擴(kuò)增出魚(yú)成分；“-”表示未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶；“+”表示有陽(yáng)性擴(kuò)增。

表2 市場(chǎng)樣本檢測(cè)比對(duì)Table 2 Detection of samples from market by Lamp and PCR

3 討論

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于鑒定病原菌、病毒、寄生蟲(chóng)、真菌以及轉(zhuǎn)基因生物等，與核酸擴(kuò)增有關(guān)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)使用4～6個(gè)引物，可針對(duì)靶標(biāo)基因的6個(gè)不同的區(qū)域。擴(kuò)增溫度可選擇60～65℃范圍內(nèi)的某個(gè)適宜溫度進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，因此，可利用恒溫水浴鍋進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)，是一種可應(yīng)用于檢測(cè)條件有限的國(guó)家或區(qū)域的技術(shù)平臺(tái)。另外，該技術(shù)相對(duì)于PCR技術(shù)反應(yīng)速度更快，靈敏度和特異性都很好[7-9]。肉及肉制品的真實(shí)性鑒別可通過(guò)基于核酸擴(kuò)增的PCR技術(shù)進(jìn)行鑒別，因此應(yīng)該也可以利用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行鑒別。本研究針對(duì)幾種主要肉成分的細(xì)胞色素b基因設(shè)計(jì)了環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)不擴(kuò)增?；蜓虺煞郑蓴U(kuò)增豬、雞、魚(yú)成分，因此可用于鑒別?；蜓虺煞种胸i、雞、魚(yú)成分的摻假鑒別。熔解曲線中溫度小數(shù)點(diǎn)后的誤差是由于測(cè)量導(dǎo)致。本方法可檢測(cè)牛肉粉中最低0.01%的豬肉粉，說(shuō)明其靈敏度可滿足實(shí)際需要。研究中選用了一種含有某種特定熒光染料的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒，并且所利用的便攜式等溫?cái)U(kuò)增儀器具有熔解曲線功能和擴(kuò)增曲線功能，分別用于鑒別引物的特異性和靶基因的擴(kuò)增情況，便于觀察反應(yīng)規(guī)律和分析。日本榮研公司生產(chǎn)的恒溫?cái)U(kuò)增DNA試劑盒基于濁度法原理，可通過(guò)在Lamp反應(yīng)中添加鈣黃綠素染料達(dá)到在紫外燈下直接觀察反應(yīng)結(jié)果的目的，按照該試劑盒的使用說(shuō)明，我們使用本方法中引物對(duì)在恒溫水浴63℃下反應(yīng)50min，在紫外燈下可觀察到反應(yīng)結(jié)果。目前，應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行肉的真實(shí)性鑒別除Minhaz Uddin Ahmed等[10]有用該技術(shù)結(jié)合電化學(xué)DNA傳感器進(jìn)行肉的鑒別外，沒(méi)有其他的報(bào)道。本研究目前僅對(duì)實(shí)驗(yàn)室易獲取的雞、豬肉等幾種動(dòng)物成分進(jìn)行了測(cè)試研究，下一步準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本范圍，進(jìn)一步研究該方法的適用范圍。

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Meat species authenticity identification by
loop-mediated isothermal amplification assay in beef and mutton

HOU Dong-jun，YANG Hong-ju，YU Lei，LI Ying，WANG Hai，JIANG Yan-bin*
（China Animal Disease Control Center，Beijing 100125，China）

A loop-mediated isothermal amplification（Lamp） method was developed for meat ingredients authenticity identification in beef and mutton.A set of universal primer used for Lamp at 63℃was chosen to differentiate animal gene encoding cytochrome b with high sensitivity.0.01%～2%pork could be detected in beef and mutton by the method.Besides，the method could be used to detect animal meats processed or unprocessed.

LAMP；authenticity；detection

TS207.3

A

1002-0306（2012）22-0060-03

2012－06－12 * 通訊聯(lián)系人

侯東軍（1975-），男，碩士，研究方向：動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全。