翟麗莎，馮 佳，謝樹蓮

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006)

泡狀饒氏藻[Jaoa bullata(Jao)Fan］屬綠藻門(Chlorophyta)綠藻綱(Chlorophyceae)。該種于1947年由饒欽止先生從貴州省湄潭縣小河急流中的巖石上發(fā)現(xiàn)并命名為 Coelodiscus bullatus[1］，隸屬饒先生之前建立的空盤藻科(Coelodiscaceae)空盤藻屬(Coelodiscus)[2-4］。泡狀饒氏藻和饒氏藻[Jaoa prasina(Jao)Fan］是饒氏藻屬僅有的2個種，為我國特有種(也有文獻認(rèn)為泡狀饒氏藻只是饒氏藻的1個變種[5-7］)。自該科屬建立以來，有的將其歸于絲藻 目 (Ulotrichales)[8］，有 的 歸 于 膠 毛 藻 目(Chaetophorales)[5，6］，有的歸于 Ctenocladales[7］.也有根據(jù)形態(tài)特點，將其歸于石莼目(Ulvales)[9，10］?？梢?，其系統(tǒng)位置一直是一個存在爭議的問題。

tufA基因是葉綠體基因組中4個翻譯因子基因的其中之一，編碼翻譯延長因子亞基，具有促進翻譯的功能。tufA已被用于區(qū)別綠藻物種的系統(tǒng)發(fā)育分析[11］。Gary的研究表明，tufA基因具有高辨識力、普遍性及好的序列質(zhì)量，且污染水平較低[12］。

以往對饒氏藻的研究多在形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)方面[9，13-14］。筆者通過試驗測定了泡狀饒氏藻的tufA基因序列，并與Genbank獲得的綠藻門其它類群的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)樹，分析它們之間的關(guān)系，以期為進一步研究饒氏藻的系統(tǒng)位置提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為泡狀饒氏藻，采自山西省平定縣娘子關(guān)泉。樣品采集后，用于形態(tài)觀察的標(biāo)本保存于4%的福爾馬林溶液中;用于DNA分析的材料在解剖鏡下挑除雜質(zhì)，用硅膠粉干燥貯存;憑證標(biāo)本保存于山西大學(xué)植物標(biāo)本館。

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA的提取

取一定量的干燥藻體于液氮中研磨，然后轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中，用SDS法提取基因組總DNA.

1.2.2 DNA 的電泳檢測

將提取的DNA產(chǎn)物進行0.8% ～1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢定樣品DNA的完整性。

1.2.3 PCR 擴增

查閱相關(guān)文獻[15］，確定引物。正向引物t36F:5'-GTTAAYATTGGAACWATTGG-3'和反向引物t1070R:5'-CCATCATCAGCWGTRAATTG-3'.

擴增反應(yīng)在美國BIO-RAD公司生產(chǎn)的PCR儀上進行。反應(yīng)體積為 25 μL，包括 1.0μL DNA 模板，2.5 μL引物 t36F，2.5 μL 引物 t1070R，2.0 μL 10 mmol/L dNTPs，2.5 μL 10 × buffer( 含 Mg2+)，14.3 μL ddH2O 及 0.2 μL Trans TaqTDNA 聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。擴增程序為:95℃，10 min預(yù)變性。循環(huán)溫度94℃，1 min;52℃，1 min;72℃，1 min;35個循環(huán)。最后72℃延伸5 min.得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶切割后參照DNA純化試劑盒使用說明進行純化回收。

1.2.4 序列測定

序列測定由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2.5 獲得相關(guān)序列

從GenBank中獲得相關(guān)基因序列，登錄號見表1.

1.2.6 軟件分析

應(yīng)用Clustal X2.0將所測序列與GenBank中所得序列進行比對[16］，人工檢查比對結(jié)果的正確性，并采用MEGA 4.0計算序列組成。構(gòu)建系統(tǒng)樹，其節(jié)點支持率使用1 000次自展(Bootstrap，BP)檢驗。利用MrBayes3.0，Phyml3.0 和 PAUP*4.0b10 軟件分別重建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用貝葉斯法(Bayes)[17］、最大似然法(ML)和最大簡約法(MP)3種建樹方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

對tufA基因序列分析測得的片段長度為957 bp.tufA 堿 基 組 成 為 A34.6%，T30.1%，C15.0%，G20.3%.A+T 含量(64.7%)明顯大于C+8G含量(35.3%)，說明tufA基因在進化上具有堿基偏好性。

表1 試驗所用基因序列GenBank登錄號

2.2 系統(tǒng)樹發(fā)育分析

以較為原始的團藻目中的Chlamydomonas reinhardtii和Volvox carteri為外類群，用貝葉斯法、最大似然法和最大簡約法分別計算得到Bayes樹，ML樹和MP樹，如圖1，圖2，圖3.圖中節(jié)點處數(shù)字代表1 000次重復(fù)(Botstrap，BP)分析得到的支持率(%)。

圖1 基于tufA基因的Bayes樹

比較圖1和圖2可知，Bayes樹和ML樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。可以看出，泡狀饒氏藻與絲藻目的Ulothrix zonata親緣關(guān)系較近，但兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹自展支持率較低，分別為52%和47%.另外，從系統(tǒng)樹位置上看，泡狀饒氏藻與鞘藻目(Oedogonia-les)的Oedogonium cardiacum和膠毛藻目的Draparnaldia plumosa也比較接近，而與石莼目的種類關(guān)系較遠(yuǎn)。MP樹(圖3)顯示的結(jié)果與前兩者略有不同，泡狀饒氏藻單獨稱為一支，但仍與鞘藻目、膠毛藻目的種類較為接近。

圖2 基于tufA基因的ML樹

圖3 基于tufA基因的MP樹

3 結(jié)論與討論

對于饒氏藻科分類系統(tǒng)的研究，以往都是從形態(tài)和解剖方面分析探討的。Papenfuss和石登紅等根據(jù)饒氏藻科植物體不具分枝及植物體呈假薄壁組織狀的形態(tài)特征，認(rèn)為與絲藻目植物不具分枝的絲狀體或膜狀體相似[8-14］，但二者在藻體大小及復(fù)雜程度上相差甚遠(yuǎn)。Printz主張將饒氏藻科列入膠毛藻目[6］，雖然該目植物體結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，但其具有異絲體性分枝的特征似也與饒氏藻科有很大的不同。Silva則認(rèn)為饒氏藻科尚未獲得廣泛承認(rèn)，應(yīng)將其放在一個分類很不穩(wěn)定的Ctenocladales中[7］。王模善等從饒氏藻科的藻體形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)入手，認(rèn)為將其歸于石莼目更合適[9］，但筆者的試驗結(jié)果卻不支持這個觀點。筆者對泡狀饒氏藻的tufA基因進行分析，顯示其與絲藻目、鞘藻目和膠毛藻目有一定關(guān)系，但未獲得較高的支持率。鑒于目前tufA基因用于藻類系統(tǒng)發(fā)育的研究報道較少，涉及到的種類較有限，有必要進行更多的基因序列分析，并將傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法科學(xué)地結(jié)合起來，才可能對饒氏藻科的分類地位得到更全面、客觀的結(jié)論。本試驗結(jié)果也為tufA基因用于藻類植物系統(tǒng)發(fā)育研究的可行性提供了證據(jù)。

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