張 懷，張示杰，陳 騫，王 巖，蘇爭明，吳向未，孫 紅

·論著·

缺氧對肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)血管內(nèi)皮生長因子和CD34表達(dá)的影響研究

張 懷，張示杰*，陳 騫，王 巖，蘇爭明，吳向未，孫 紅

目的 探討體外缺氧條件下肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、CD34表達(dá)水平的變化。方法 2016年4—10月，選取實驗用腹腔感染肝泡狀棘球蚴18周的長爪沙鼠30只，采用頸椎脫臼法處死，選取光滑、成簇的游離于腹腔或附著在腹壁、腸系膜、肝表面的肝泡狀棘球蚴組織。培養(yǎng)肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)，分為兩組，對照組和實驗組(給予含100 μmol/L二氯化鈷的RPMI 1640培養(yǎng)基)，培養(yǎng)第0、6、12、18、24 h倒置顯微鏡下觀察肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)活力。培養(yǎng)12、24 h采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)中缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、VEGF、CD34表達(dá)水平,Western blotting法檢測肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)中VEGF、CD34的表達(dá)。結(jié)果 培養(yǎng)0、6、12、18、24 h，對照組與實驗組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)活力比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)12、24 h，實驗組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)HIF-1α、VEGF、CD34表達(dá)水平較對照組升高(P<0.05)。結(jié)論 缺氧可以使肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)中VEGF和CD34表達(dá)水平升高，這可能是肝泡狀棘球蚴病呈浸潤性生長的重要機(jī)制之一。

棘球蚴病，肝；缺氧；血管內(nèi)皮生長因子類；CD34

張懷，張示杰，陳騫,等.缺氧對肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)血管內(nèi)皮生長因子和CD34表達(dá)的影響研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(14)：1702-1706.[www.chinagp.net]

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本研究背景及創(chuàng)新點：

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管新生的關(guān)鍵遞質(zhì)之一，CD34為公認(rèn)的標(biāo)記肝癌新生血管特異性最好的指標(biāo)之一；實驗研究發(fā)現(xiàn)缺氧引起的血管新生是肝癌浸潤性生長的重要原因；因此VEGF、CD34被廣泛應(yīng)用于肝癌的研究中。肝泡狀棘球蚴病的浸潤方式與肝癌的浸潤生長方式相似，本實驗較創(chuàng)新地把VEGF、CD34用在肝泡狀棘球蚴病的研究中，通過體外模擬肝泡狀棘球蚴在人體內(nèi)生長環(huán)境，利用外源性二氯化鈷成功建立肝泡狀棘球蚴缺氧模型，給予缺氧一定時間后，發(fā)現(xiàn)VEGF、CD34表達(dá)水平升高，說明缺氧可以導(dǎo)致VEGF、CD34表達(dá)上調(diào)，這與肝癌研究中得出的缺氧引起血管新生導(dǎo)致肝癌呈浸潤性生長的結(jié)論相吻合，說明缺氧引起的血管新生可能是肝泡狀棘球蚴病呈浸潤性生長的關(guān)鍵途徑之一，為治療肝泡狀棘球蚴病提出了一種新的可行性方法。

肝泡狀棘球蚴病是由多房棘球蚴的幼蟲感染引起的人獸共患病，因此又被稱為多房棘球蚴病，該病對人體健康的危害十分嚴(yán)重[1-2]。經(jīng)消化道進(jìn)入血液后，成蟲幾乎全部寄生在肝臟，呈類似于惡性腫瘤的浸潤性生長，并且主要通過血行擴(kuò)散、種植轉(zhuǎn)移、浸潤擴(kuò)散、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方式向遠(yuǎn)處組織器官進(jìn)行轉(zhuǎn)移，臨床上與肝癌鑒別困難，故又稱為“蟲癌”或“惡性包蟲病”[3]。研究證明，缺氧引起的血管新生是導(dǎo)致肝癌浸潤性生長的主要原因之一，而血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和CD34在腫瘤新生血管形成及侵襲性生長過程中起重要作用[4]。因此，本實驗通過二氯化鈷模擬體內(nèi)缺氧條件，培養(yǎng)肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)，觀察缺氧對肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)VEGF、CD34表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 2016年4—10月，于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購買實驗用腹腔感染肝泡狀棘球蚴18周的雌性長爪沙鼠30只，體質(zhì)量(50±5)g；RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；二氯化鈷購于美國Sigma公司；小鼠VEGF單克隆抗體購于美國Abcam公司；小鼠CD34單克隆抗體購于美國Santa公司；山羊抗小鼠二抗(型號ZB-2305)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、VEGF ELISA試劑盒、CD34ELISA試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司(Elabscience)。

1.2 方法

1.2.1 肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)的提取 采用頸椎脫臼法處死種鼠，無菌剖腹，選取光滑、成簇的游離于腹腔或附著在腹壁、腸系膜、肝表面的肝泡狀棘球蚴組織，置于無菌盤中，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，依次剪碎，勻漿，過篩，PBS漂洗3次，0.5%伊紅染色，5 min后，倒置顯微鏡下觀察，肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)染色情況即肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)的活力。

1.2.2 體外肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)的培養(yǎng)與缺氧誘導(dǎo) 肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)置于RPMI 1640培養(yǎng)基中，分為兩組，對照組37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；實驗組給予含100 μmol/L二氯化鈷的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)活力檢測 培養(yǎng)第0、6、12、18、24 h分別取實驗組與對照組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)，倒置顯微鏡下觀察生長發(fā)育狀況及運(yùn)動情況，并且每孔取10 μl肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)懸混液，置于載玻片上，再加入等體積的0.5%伊紅溶液，5 min后，倒置顯微鏡下觀察肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)活力。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 ELISA法檢測肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)中HIF-1α、VEGF、CD34表達(dá)水平 分別收集實驗組與對照組培養(yǎng)12、24 h的肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)，PBS反復(fù)沖洗后，用超聲破碎儀碎裂肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)，ELISA雙抗體夾心法測定肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)中的HIF-1α、VEGF、CD34表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用波長為450 nm的全自動酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，通過測試標(biāo)本的吸光度，并于標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其對應(yīng)濃度。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 Western blotting法檢測肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)中VEGF、CD34的表達(dá) 分別收集實驗組與對照組培養(yǎng)12、24 h的肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)，PBS反復(fù)沖洗后，用超聲破碎儀碎裂肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)，并在100 ℃下煮沸10 min，蛋白變性后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。各取等量蛋白樣?0 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至45 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入小鼠VEGF單克隆抗體(1∶1 000)及小鼠CD34單克隆抗體(1∶500)一抗，4 ℃過夜，TBST洗滌6次；山羊抗小鼠IgG辣根酶標(biāo)記(1∶50 000)及山羊抗小鼠IgG辣根酶標(biāo)記(1∶2 000)二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌6次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，暗房曝光。以β-actin為內(nèi)對照，以各目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)對照比值作為陽性條帶的相對表達(dá)值。采用法國Vilber Lourmat公司的Biorad數(shù)碼成像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)活力比較 培養(yǎng)0、6、12、18、24h，對照組與實驗組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)活力比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

Table1Comparisonofechinococcosisprotoscolexactivitybetweencontrolgroupandexperimentgroup

組別培養(yǎng)0h培養(yǎng)6h培養(yǎng)12h培養(yǎng)18h培養(yǎng)24h對照組83.4±0.483.0±1.482.4±1.081.8±0.780.8±0.6實驗組83.4±0.382.8±1.182.1±1.381.2±0.579.9±0.6t值00.110.180.690.99P值1.000.920.860.530.38

2.2 HIF-1α表達(dá)水平比較 培養(yǎng)12、24 h，實驗組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)HIF-1α表達(dá)水平較對照組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table2ComparisonofHIF-1αexpressionlevelinechinococcosisprotoscolexbetweencontrolgroupandexperimentgroup

組別培養(yǎng)12h培養(yǎng)24h對照組624±79868±127實驗組976±791177±85t值5.473.50P值0.010.03

2.3 VEGF表達(dá)水平比較 培養(yǎng)12、24 h，實驗組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)VEGF表達(dá)水平較對照組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3、圖1)。

2.4 CD34表達(dá)水平比較 培養(yǎng)12、24 h，實驗組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)CD34表達(dá)水平較對照組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4、圖2)。

Table3ComparisonofexpressionlevelofVEGFinechinococcosisprotoscolexbetweencontrolgroupandexperimentgroup

組別培養(yǎng)12h培養(yǎng)24h對照組106±9155±27實驗組182±17230±18t值6.694.03P值<0.010.02

注：VEGF=血管內(nèi)皮生長因子

圖1 Western blotting法檢測兩組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)VEGF表達(dá)

Figure 1 Detection of expression of VEGF in echinococcosis protoscolex by Western blotting method

Table4ComparisonofexpressionlevelofCD34inechinococcosisprotoscolexbetweencontrolgroupandexperimentgroup

組別培養(yǎng)12h培養(yǎng)24h對照組479±42584±59實驗組603±44869±54t值3.536.21P值0.02<0.01

圖2 Western blotting法檢測兩組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)CD34表達(dá)

Figure 2 Detection of expression of CD34in echinococcosis protoscolex by Western blotting method

3 討論

既往研究證明，在異常情況下的血管新生是導(dǎo)致惡性腫瘤浸潤性生長的關(guān)鍵，而在人體正常組織中血管新生是被高度管制的行為[5]。在血管新生中，VEGF是其中的關(guān)鍵遞質(zhì)之一。而目前所有已知血管內(nèi)皮標(biāo)志物中公認(rèn)的最能特異性標(biāo)記肝癌的新生血管指標(biāo)是CD34。研究發(fā)現(xiàn)，血管新生主要是由缺氧誘導(dǎo)，其觸發(fā)因素中最重要的是組織缺氧[6]。而HIF-1α的表達(dá)呈負(fù)氧依賴性，即在低氧的環(huán)境下，HIF-1α呈高表達(dá)[7]。因此，本研究通過二氯化鈷模擬體內(nèi)缺氧條件培養(yǎng)肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)，觀察缺氧對肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)VEGF、CD34表達(dá)的影響。

研究證明，隨著腫瘤細(xì)胞不斷增殖，造成了腫瘤組織中心區(qū)域的乏氧，因此，缺氧是腫瘤生長發(fā)育過程中的必然因素[8]。此時，缺氧區(qū)域的營養(yǎng)來源依賴于瘤體血管的新生。體外研究中常用的辦法是在培養(yǎng)基中加入一定劑量的二氯化鈷(100 μmol/L)、去鐵敏(100 μmol/L)等藥物來創(chuàng)造缺氧環(huán)境，以此模擬體內(nèi)缺氧微環(huán)境。本研究通過二氯化鈷誘導(dǎo)肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)缺氧環(huán)境，結(jié)果顯示：培養(yǎng)12、24 h，實驗組HIF-1α表達(dá)水平明顯升高，說明二氯化鈷缺氧模型建立成功[9]。兩組培養(yǎng)0、6、12、18、24 h肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)活力均無差異，表明二氯化鈷誘導(dǎo)24 h內(nèi)，缺氧對肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)活力沒有影響。

多種腫瘤細(xì)胞可分泌VEGF，VEGF是目前學(xué)術(shù)界已知的促進(jìn)血管生成的最強(qiáng)因子之一，可以增加血管的通透性，誘導(dǎo)腫瘤中的血管生成，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤的侵襲性生長及轉(zhuǎn)移[10]。李興睿等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞系HepG2缺氧培養(yǎng)24 h，VEGF水平明顯升高。同時，陳俊偉等[12]成功地利用二氯化鈷建立缺氧模型，在大鼠肝癌細(xì)胞株RH35中，VEGF mRNA表達(dá)與缺氧程度呈正相關(guān)，且隨著HIF-1α的增加而上升。本研究對肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)進(jìn)行缺氧培養(yǎng)，ELISA和Western blotting法檢測肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)VEGF表達(dá)，結(jié)果顯示，培養(yǎng)12、24 h，實驗組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)VEGF表達(dá)水平較對照組升高，說明缺氧導(dǎo)致VEGF表達(dá)增多，這可能與缺氧導(dǎo)致體內(nèi)HIF-1α表達(dá)增多，進(jìn)一步上調(diào)VEGF表達(dá)有關(guān)，但是具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

CD34是常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，實驗研究表明，CD34既有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能，同時又具備了造血功能，這就使得血管新生具備了條件，為腫瘤的浸潤性生長提供了所需的營養(yǎng)物質(zhì)[13]。CUI等[14]對大鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)低氧會上調(diào)CD34的表達(dá)來促進(jìn)血管新生。NISHIMURA等[15]在實驗中發(fā)現(xiàn)，缺氧可以上調(diào)C57BL6雄性小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34的表達(dá)。本研究中，培養(yǎng)12、24 h，實驗組肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)CD34表達(dá)水平較對照組升高，這可能與CD34促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移來促進(jìn)組織血管的生成有關(guān)[13]，缺氧使得肝泡狀棘球蚴原頭節(jié)迫切需求新生血管提供的氧及其他營養(yǎng)物質(zhì)。

綜上所述，本研究利用二氯化鈷建立缺氧模型，結(jié)果顯示缺氧可導(dǎo)致VEGF、CD34表達(dá)上調(diào)，說明肝泡狀棘球蚴的浸潤性生長可能與缺氧引起VEGF、CD34表達(dá)升高導(dǎo)致的血管新生有關(guān)；國內(nèi)外暫未見相關(guān)研究報道，本研究為肝泡狀棘球蚴的浸潤性生長的原因提供了新的可能；但是，本研究僅從體外方面提出缺氧與VEGF、CD34表達(dá)的關(guān)系，還需動物實驗進(jìn)一步證明，這也是本課題組今后的工作重點。同時，在臨床治療過程中，可以給予相關(guān)的抑制干預(yù)處理，為藥物治療肝泡狀棘球蚴病提出了一種新的可行性方法。

作者貢獻(xiàn)：張懷、張示杰進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；張懷、陳騫進(jìn)行研究的實施與可行性分析；張懷進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計學(xué)處理，撰寫論文；張懷、王巖進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；張懷、蘇爭明進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；張示杰、吳向未進(jìn)行論文的修訂；孫紅負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Effect of Anoxia on Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and CD34in Hepatic Alveolar Echinococcosis Protoscolex

ZHANGHuai,ZHANGShi-jie*,CHENQian,WANGYan,SUZheng-ming,WUXiang-wei,SUNHong

TheFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China

*Correspondingauthor:ZHANGShi-jie,Professor,Mainresearchdirections:hepatobiliarysurgery;E-mail:zhangshijiewk1@sina.com

Objective To investigate the expression level of vascular endothelial growth factor(VEGF) and CD34in the hepatic alveolar echinococcosis protoscolex under the condition of vitro anoxia.Methods From April to October in 2016,the 30 cases gerbils of abdominal infection with hepatic alveolar echinococcosis for 18 weeks were selected for experiment,and were sacrificed by cervical dislocation.The smooth clusters of hepatic alveolar echinococcosis tissues isolated in abdominal cavity or tissues adhere to the abdominal wall,mesentery,liver surface were selected.The hepatic alveolar echinococcosis protoscolex was cultured to divide into control group and experiment group(RPMI 1640 medium containing 100 μmol/L cobalt chloride).The hepatic alveolar echinococcosis protoscolex activity was observed by inverted microscope at the beginning,and the 6th,12th,18th,24th hour of the culture process.At the 12th and 24th hour of the culture process,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect the expression level of hypoxia-inducible factor 1 alpha(HIF-1α),VEGF and CD34in hepatic alveolar echinococcosis protoscolex.Western blotting method was applied to detect the expression of VEGF and CD34.Results The echinococcosis protoscolex activity at the 0th,6th,12th,18th,24th hour of the culture process was not significantly different between control group and experiment group(P>0.05).Compared with the control group,the expression level of HIF-1α,VEGF,CD34were significantly increased at the 12th and 24th hour of the culture process in the experiment group(P<0.05).Conclusion Hypoxia can increase the expression level of VEGF and CD34in echinococcosis protoscolex,and this may be one of the important mechanisms of invasive growth presented by hepatic alveolar echinococcosis.

Echinococcosis,hepatic；Anoxia；Vascular endothelial growth factors；CD34

國家自然科學(xué)基金資助項目(81560518)

R 532.32

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.14.011

2016-11-12；

2017-02-22)

832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院

*通信作者：張示杰，教授，主要研究方向：肝膽外科；E-mail：zhangshijiewk1@sina.com