李 婷, 韓麗君 袁 毅

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

不同有機(jī)溶劑對(duì)雨生紅球藻中蝦青素提取成分的影響

李 婷1,2, 韓麗君1, 袁 毅1

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

研究了有機(jī)溶劑提取雨生紅球藻中蝦青素過程中, 不同液料比對(duì)提取效率的影響, 并以分光光度法及高效液相色譜法(HPLC), 檢測(cè)了不同有機(jī)溶劑對(duì)提取組分及主要組分(葉綠素和蝦青素)含量的影響。結(jié)果顯示, 提取率隨著液料比的增加而上升, 當(dāng)液料比大于20：1時(shí), 其升高變緩, 趨于平衡; 不同有機(jī)溶劑提取物的化學(xué)組分無明顯差異, 但各組分含量的比例差異較大, 如二氯甲烷提取物在 480 nm下吸光度為30.64±0.54, 高于丙酮、乙酸乙酯及甲醇(分別為27.68±5.54、25.32±8.43及24.31±0.79), 而645和663 nm下吸光度為2.54±0.46和5.33±0.19, 較丙酮、三氯甲烷、無水乙醇及甲醇(分別為5.70±0.71、12.87±0.14、7.60±0.23及6.44±0.28)低, 說明該種溶劑對(duì)于蝦青素有較高的提取效率, 但其揮發(fā)性強(qiáng)且毒性大, 而無水乙醇的提取率略低于二氯甲烷, 具有安全、低毒的優(yōu)勢(shì), 因此無水乙醇是較為合適的蝦青素提取溶劑。

蝦青素; 雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis); 溶劑類型; 分光光度法; HPLC

蝦青素(astaxanthin, 3, 3' -二羥基-4, 4 -二酮基-β,β' -胡蘿卜素), 是水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)最主要的類胡蘿卜素之一。據(jù)報(bào)道, 蝦青素的抗氧化性比 β-胡蘿卜素高10倍以上, 比維生素E高500倍以上, 被稱為“超級(jí)維生素E”[1]。蝦青素還可作為著色劑應(yīng)用于貴重水產(chǎn)品及禽類養(yǎng)殖以增加其附加商品值, 此外, 人體也可選擇性積累蝦青素, 增加機(jī)體免疫力等, 因此近年來受到廣泛關(guān)注。

目前, 蝦青素主要來源于化學(xué)合成及蝦蟹下腳料、紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)和雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)。其中化學(xué)合成困難且安全性未被證實(shí)[2]; 蝦蟹下腳料多采用堿提, 對(duì)環(huán)境污染較為嚴(yán)重; 紅法夫酵母含量低需要進(jìn)行高產(chǎn)菌株選育。

雨生紅球藻是一種廣泛分布于自然界的淡水綠藻, 它有兩種細(xì)胞形態(tài), 即綠色的營養(yǎng)細(xì)胞和紅色的厚壁孢子, 只有厚壁孢子能夠積累類胡蘿卜素,其中80%以上為蝦青素[1]。在雨生紅球藻中, 70%的蝦青素以單酯的形式存在, 25%以二酯存在, 而只有約5%為游離蝦青素[3]。雖然雨生紅球藻的應(yīng)用和研究雖然受到了微藻研究界的重視, 但目前雨生紅球藻培養(yǎng)還處于實(shí)驗(yàn)室階段, 大規(guī)模生產(chǎn)尚存在許多問題。

另外, 紅球藻的色素提取比較困難, 常用方法包括有機(jī)溶劑提取、植物油提取[4]及超臨界二氧化碳提取[5-7]等。其中植物油提取雖然安全性較高, 但植物油沸點(diǎn)高, 后期處理不易; 超臨界二氧化碳提取是現(xiàn)在較為流行的方法, 但其成本較高。目前工業(yè)上的分離提取常用有機(jī)溶劑法, 因?yàn)橛袡C(jī)溶劑容易分離且可以重復(fù)利用, 具有成本低效率高的優(yōu)點(diǎn)。因此本文采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取的方法, 比較了不同溶劑提取的雨生紅球藻蝦青素提取物的效率及成分差異, 目的在于尋找提取雨生紅球藻中蝦青素安全、有效的有機(jī)溶劑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

雨生紅球藻, 云南愛爾發(fā)生物技術(shù)有限公司提供, 冷凍干燥并低溫破碎;

甲醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、無水乙醇、乙酸乙酯均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Unico UV-2000分光光度計(jì)： 尤尼科(上海)儀器有限公司; 離心機(jī)： SC-3610低速離心機(jī), 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司; 高效液相色譜儀： 島津CBM-20A 系統(tǒng)控制器; LC-6AD/7A 高壓泵;SPD-20A檢測(cè)器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蝦青素含量的測(cè)定

稱取冷凍干燥并破碎后的藻粉約0.5 g, 加入20 mL丙酮, 研磨10 min后抽濾, 收集上清, 重復(fù)該步驟至藻渣呈灰白色, 合并上清, 棕色容量瓶(20℃,100 mL)定容, 稀釋10倍后測(cè)定其480、645 及663 nm下的吸光值, 每個(gè)樣品讀數(shù)3次。測(cè)定3個(gè)平行。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在避光條件下進(jìn)行。

1.3.2 提取液料比的確定

稱取6份紅球藻粉置離心管中, 分別加入5、10、15、20、30、50倍體積的丙酮, 超聲提取 3 min后3500 r/min離心 10 min, 收集上清液至棕色容量瓶(20℃, 100 mL)定容, 分光光度計(jì)測(cè)定其480、645及663 nm下吸光度, 每個(gè)樣品讀數(shù)3次。重復(fù)3次, 取平均值。

1.3.3 不同溶劑對(duì)蝦青素提取的影響

用丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇、甲醇等實(shí)驗(yàn)室常用溶劑以2.3.2方法進(jìn)行紅球藻中蝦青素的提取實(shí)驗(yàn), 每個(gè)樣品讀數(shù)3次, 每種溶劑重復(fù) 3次, 取平均值, 并將各溶劑提取物進(jìn)行HPLC分析。

色譜條件[8]： 色譜柱為島津C18反相柱(4.6 mm×25 cm), 流動(dòng)為丙酮(A)和甲醇/水(9：1), 洗脫程序?yàn)锽相80%～20% 洗脫25 min, 然后20%保持10min,最后20%～80%洗脫5 min, 流速1.25 mL/min, 檢測(cè)波長 476 nm, 柱溫 25℃, 進(jìn)樣量 10 μL。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 紅球藻中蝦青素含量

根據(jù)下列公式[9]計(jì)算蝦青素含量, 結(jié)果見表1。

表1 雨生紅球藻中蝦青素含量計(jì)算結(jié)果Tab. 1 Content of astaxanthin in the Haematococcus pluvialis

C(mg/kg) = 4.6×(OD480- 0.638×OD645+ 0.114×OD663)×稀釋倍數(shù)

其中C為紅球藻中蝦青素的質(zhì)量濃度(mg/kg);OD480、OD645、OD663分別為提取液在 480、645及663 nm處的吸光度值; 稀釋倍數(shù)為提取液終體積(mL)與稱取藻粉質(zhì)量m(g)之比。

2.2 蝦青素提取液料比的確定

以 5、10、15、20、30、50倍體積的丙酮提取雨生紅球藻中的蝦青素, 其結(jié)果見圖 1。由圖 1可知 20倍體積以下時(shí), 提取效率隨溶劑的增加而迅速上升,而后增加不明顯, 因此, 液料比為20時(shí)為最佳比例。

圖1 不同液料比的蝦青素提取效率Fig. 1 Extraction rate of astaxanthin with different solvent volume/algal weight ratio

2.3 溶劑對(duì)蝦青素提取的影響

不同溶劑以 20倍體積提取蝦青素并定容后,Unico UV-2000測(cè)定其各吸光度值, 計(jì)算得到其與稱取藻粉質(zhì)量之比(表2)。不同溶劑提取物35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后, 溶于色譜純丙酮, 溶液以0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析, 結(jié)果顯示, 主要洗脫峰差異不大(圖2)。圖2-A中標(biāo)示了蝦青素酯的洗脫峰, 由于其結(jié)合的脂肪酸不同, 導(dǎo)致保留時(shí)間有所差異, 所以蝦青素酯峰分布較廣, 而葉綠素的峰與蝦青素酯峰混在一起, 保留時(shí)間在20～25 min之間。另外, 游離蝦青素在甲醇和乙醇中溶解度較小, 綜合考慮液料比可以提高其提取效率。

表2 不同溶劑蝦青素提取液的吸光度值與藻粉質(zhì)量之比(mean±S.D.)Tab. 2 Absorbance value/algal weight ratio extracted with different solvents (mean±S.D.)

圖2 不同溶劑提取物的HPLC圖譜Fig. 2 HPLC chromatography of different extractsA. 丙酮; B. 三氯甲烷; C. 乙酸乙酯; D. 二氯甲烷; E. 無水乙醇; F. 甲醇A.acetone; B. chloroform; C.ethyl acetate; D.dichloromethane; E. absolute ethanol; F.methanol

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所采用的雨生紅球藻粉蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.9%, , 該雨生紅球藻質(zhì)量分?jǐn)?shù)比報(bào)道的蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1.5%～3%)低[1], 其原因可能是蝦青素在有氧環(huán)境中易發(fā)生氧化, 在保存或提取過程中有所損失。以 5倍體積丙酮提取蝦青素時(shí), 提取率僅為61.9%, 而在液料比為20：1時(shí), 一次提取率即可達(dá)到82.9%, 隨后提取率隨液料比增加不明顯, 可以看出,液料比為20：1時(shí)較為合適。

有機(jī)溶劑浸提紅球藻時(shí), 提取液中不但含有類胡蘿卜素(其中 80%以上為蝦青素), 還有葉綠素, 而葉綠素除了在645 nm和663 nm有最大吸收外, 在480 nm也有較大吸收, 對(duì)蝦青素含量的測(cè)定有一定的影響, 因此, 本實(shí)驗(yàn)除了測(cè)定提取液在480 nm處的吸收值, 同時(shí)測(cè)定了其在645、663 nm的吸收值,以校正葉綠素對(duì)蝦青素含量測(cè)定的影響。從結(jié)果可以看出, 乙酸乙酯提取物中葉綠素含量最低, 但同時(shí)其蝦青素提取量也較低; 雖然三氯甲烷 OD480/m值最大, 但其他兩個(gè)值均最高, 即葉綠素和蝦青素的含量都較高, 因此不能判定三氯甲烷蝦青素提取率最高; 而二氯甲烷提取物同時(shí)具備了 OD480/m值較大, 后兩個(gè)值較小的優(yōu)點(diǎn), 即提取物中蝦青素含量高, 而葉綠素含量低。但是二氯甲烷揮發(fā)性強(qiáng)、毒性較大, 雖然無水乙醇提取效率稍次于二氯甲烷,但由于具安全性高的優(yōu)點(diǎn), 使無水乙醇成為最適宜的溶劑。

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Effect of Solvents on extract of astaxanthin from green algae Haematococcus pluvialis

LI Ting1,2, HAN Li-Jun1, YUAN Yi1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Mar.,14,2011

Astaxanthin; Haematococcus pluvialis; Slovent types; Spectrophotography; HPLC

In this paper, the effects of different solvent-algae ratios and solvent types on the extract of astaxanthin from H. pluvialis were investigated using methods of spectrophotography and high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that extract capacity is positively correlated to the solvent-algae ratio. The extract capacity was rapidly increased with the increase of solvent-algae ratio, and the tendency slowed down when the ratio reached 20：1 (v/w). The solvent type did not affect the components of extracts, but it influenced the component content. Extract using dichloromethane obtained high proportion of astaxanthin (the OD480is 30.64±0.54,which is higher than most of other solvents), and low content of chlorophyll (the OD645is 2.54±0.46, and OD663is 5.33±0.19, which are lower than most of other solvents). However, dichloromethane possesses strong volatility and toxicity. The extract capacity of absolute ethyl alcohol is slightly lower than dichloromethane, but it is much less toxic and more safe than dichloromethane. Hence, absolute ethyl alcohol is the best solvent than others for astaxanthin extract.

P745

A

1000-3096(2012)07-0034-05

2011-03-14;

2011-04-25

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(863計(jì)劃)(2007AA091604)

李婷(1985-), 女, 山西運(yùn)城人, 碩士研究生, 從事海洋生物活性物質(zhì)的研究, 電話： 0532-82898702, E-mail： l.double.t@163.com;韓麗君, 通信作者, 電話： 0532-82898702, E-mail： ljhan@qdio.ac.cn

(本文編輯：康亦兼)