王洪斌, 成 明, 錢 鵬, 李士虎, 閻斌倫

(1. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室, 江蘇 連云港 222005;3. 連云港市榮盛生物科技有限公司, 江蘇 連云港 222005)

金屬離子對中肋骨條藻的脅迫效應(yīng)及葉綠素a合成的影響

王洪斌12, 成 明3, 錢 鵬1, 李士虎1, 閻斌倫2

(1. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室, 江蘇 連云港 222005;3. 連云港市榮盛生物科技有限公司, 江蘇 連云港 222005)

研究中肋骨條藻(Skeletonema costatum)生長對不同質(zhì)量濃度的5種金屬離子脅迫的響應(yīng), 探討5種金屬離子對中肋骨條藻葉綠素a合成的影響。結(jié)果顯示: 生長方面, 中肋骨條藻對Cd2+和Ba2+的響應(yīng)較明顯, 培養(yǎng)至第10天, Cd2+質(zhì)量濃度為1、10 mg/L組生長量僅有對照組的59%及43.6%; Ba2+質(zhì)量濃度為2 mg/L組到第10天是對照組的69.4%, 而0.5 mg/L組超過對照組38.9%; 中肋骨條藻對其他金屬離子的脅迫響應(yīng)不明顯; 葉綠素合成方面, Cd2+質(zhì)量濃度為1 mg/L時, 葉綠素a合成量達(dá)最高, 高于對照組157%; 而Ba2+質(zhì)量濃度為0.5、1 mg/L時, 超出對照組的116%和483%; 其他金屬離子對中肋骨條藻葉綠素a合成均起抑制作用, 各個質(zhì)量濃度組均低于對照組, 其中 Pb2+質(zhì)量濃度為0.3 mg/L、Mn2+質(zhì)量濃度為1 mg/L及Li+質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時, 葉綠素a含量達(dá)最低值, 僅為對照組的34.1%、37.5%和17.6%; 結(jié)論是質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的Ba2+可促進(jìn)中肋骨條藻的生長及葉綠素的合成, 對其產(chǎn)業(yè)化規(guī)模培養(yǎng)具有重要意義。

中肋骨條藻(Skeletonema costatum); 金屬離子; 脅迫; 響應(yīng)

由于海洋微藻營養(yǎng)豐富, 富含微量元素和各類生物活性物質(zhì), 而且易于人工繁殖, 繁殖周期短, 生長速度快, 所以在醫(yī)藥、保健品、化妝品、水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料、飼料添加劑、化工和環(huán)保等方面具有廣闊的應(yīng)用前景, 是非常重要的可更新資源[1]。因此, 對海藻的研究和開發(fā)利用已經(jīng)在中國、日本、韓國、智利、瑞典、美國和南非等國家和地區(qū)蓬勃開展起來[2-10]。

本實驗以中肋骨條藻(Skeletonema costatum)為供試材料, 研究其生長及葉綠素 a合成對不同質(zhì)量濃度的 5種金屬離子的響應(yīng), 旨在提示利用藻類富集金屬離子及凈化金屬廢水是可行的, 尋找對藻類生長有促進(jìn)作用的低質(zhì)量濃度金屬離子, 對藻類的純化和產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用微藻中肋骨條藻(Skeletonema costatum)由孫穎穎博士惠贈。海水培養(yǎng)液采用f/2 加富的米勒氏工人海水, 微藻培養(yǎng)所用海水采自連云港高公島海域(鹽度約 31.00~32.00)漲潮時, 醋酸纖維薄膜過濾, 121℃、20 min滅菌待用; 蒸餾水采用一般蒸餾水,滅菌要求同海水, 實驗所用的試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 中肋骨條藻培養(yǎng)方法

取20 mL藻種按照1 : 9比例接種至500 mL錐形瓶中, 加入 180 mL滅過菌的蒸餾水, 搖勻, 共接種5瓶, 然后放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。溫度22 , ℃光強3 000 lx, 光暗比12 h : 12 h。每日定時搖動培養(yǎng)瓶3次, 防止藻細(xì)胞貼壁生長(如未做特別說明, 后續(xù)實驗培養(yǎng)條件均與之相同)。搖瓶時隨機調(diào)換錐形瓶的順序, 以減少誤差。

1.2.2 中肋骨條藻生長測定

取培養(yǎng)至第 4天的藻液, 分別加入不同質(zhì)量濃度的金屬鹽溶液, Pb2+質(zhì)量濃度設(shè)置為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 6個梯度, Cd2+設(shè)置為 0、0.1、0.5、1、2、10 mg/L 6 個梯度, Mn2+、Li+、Ba2+質(zhì)量濃度分別設(shè)置為 0、0.1、0.5、1、2、5 mg/L 6種梯度, 其他成分含量不變, 蒸餾水作為空白對照, 采用分光光度法測定其在680 nm處的生長量, 記錄數(shù)據(jù), 直到第10天為止。

比生長速率計算:K= (lnNt-lnN0)/T。其中K為相對增長速率,N0為藻液起始質(zhì)量濃度,Nt為培養(yǎng)t時間后的藻液質(zhì)量濃度,T為培養(yǎng)時間(h)。

1.2.3 中肋骨條藻葉綠素a含量測定

采用熱乙醇萃取分光光度法[11], 取10 mL培養(yǎng)至20 d的藻液, 5℃、6 000 r/min離心5 min, 棄上清液, 取沉淀－20℃下冷凍12 h。取出后迅速用9 mL 95%乙醇(80)℃于80℃熱水浴萃取2 min, 再用超聲波清洗儀超聲振蕩處理10 min, 于4℃黑暗靜置6 h后, 5℃、6 000 r/min離心5 min, 取上清, 用分光光度計于波長 665 nm和 750 nm測定A值, 加入 1 mol/L鹽酸酸化, 于波長665 nm和750 nm處再測定A值。

2 結(jié)果與分析

2.1 中肋骨條藻生長及生長速率對不同質(zhì)量濃度的金屬離子的響應(yīng)

2.1.1 中肋骨條藻生長量對不同質(zhì)量濃度Cd2+的響應(yīng)

由圖 1可知, 實驗組的生長情況都要差于對照組, 以10 mg/L組最為明顯, 在第7天出現(xiàn)高峰, 然后下降, 到第10天, 10 mg/L組的生長量只有對照組的43.6%。對照組的生長量一直處于上升狀態(tài), 0.1、0.5、1 mg/L和2 mg/L實驗組生長量在第10天分別是對照組的74%、67%、59%和72%。

圖1 中肋骨條藻生長量對不同質(zhì)量質(zhì)量濃度Cd2+的響應(yīng)Fig. 1 Response of the growth of Skeletonema costatum to different concentrations of Cd2+

2.1.2 中肋骨條藻生長量對不同質(zhì)量濃度Pb2+的響應(yīng)

由圖2得知, Pb2+質(zhì)量濃度0.4 mg/L時, 對中肋骨條藻生長的影響最為明顯, 整個培養(yǎng)過程, 0.4 mg/L實驗組生長量始終低于對照組; 其他質(zhì)量濃度實驗組對中肋骨條藻生長的影響不明顯, 僅顯示微弱的抑制作用。所有實驗組的比生長速率均小于對照組。

圖2 中肋骨條藻生長量對不同質(zhì)量濃度Pb2+的響應(yīng)Fig. 2 Response of the growth of Skeletonemacostatum to different concentrations of Pb2+

2.1.3 中肋骨條藻生長量對不同質(zhì)量濃度 Mn2+的響應(yīng)

從圖3可以看出, 隨著培養(yǎng)時間的增加, 各質(zhì)量濃度實驗組與對照組之間的差距越來越小, 到第 10天, 各組的生長量基本一致。僅0.1 mg/L和5 mg/L實驗組的生長量始終低于對照組, 尤其是5 mg/L組,到第 5、6天, 生長量只有對照組的 67.4%, 至第 10天僅顯示微弱抑制作用。

0.1 mg/L組的比生長速率最低, 為對照組的94.4%。

圖3 中肋骨條藻生長量對不同質(zhì)量濃度Mn2+的響應(yīng)Fig. 3 Response of the growth of Skeletonema costatum to different concentrations of Mn2+

2.1.4 中肋骨條藻生長量對不同質(zhì)量濃度Li+的響應(yīng)

由圖4可知, 2 mg/L和5 mg/L實驗組對中肋骨條藻生長影響明顯, 顯示出較好的抑制效果, 到第10天, 兩組生長量分別是對照組的74%、71%, 而且在整個培養(yǎng)過程中, 始終低于對照組。所有實驗組的比生長速率都要低于對照組, 2 mg/L組比生長速率最低, 僅為對照組的76.9%, 其余4組的比生長速率與對照組相差不大。

圖4 中肋骨條藻生長量對不同質(zhì)量濃度Li+的響應(yīng)Fig. 4 Response of the growth of Skeletonema costatum to different concentrations of Li+

2.1.5 中肋骨條藻生長量對不同質(zhì)量濃度Ba2+的響應(yīng)

由圖5可知, 0.1、0.5 mg/L和1 mg/L實驗組生長量始終高于對照組, 以0.1、0.5 mg/L組最為明顯,到第10天, 生長量超出對照組的36%、39%。2 mg/L實驗組生長量一直低于對照組, 第10天僅是對照組的69%。0.1 mg/L和0.5 mg/L兩組生長量之間差距很小, 生長量隨著培養(yǎng)時間的增加而上升。比生長速率在0.1 mg/L時達(dá)到頂峰, 高于對照組25.5%, 然后隨著質(zhì)量濃度增加而逐漸下降, 在2 mg/L時達(dá)到最低值, 為對照組的66%。

圖5 中肋骨條藻生長量對不同質(zhì)量濃度Ba2+的響應(yīng)Fig. 5 Response of the growth of Skeletonema costatum to different concentrations of Ba2+

2.2 中肋骨條藻葉綠素 a含量對不同質(zhì)量濃度的金屬離子的響應(yīng)

由圖6得知, 葉綠素a含量在Cd2+質(zhì)量濃度0.1 mg/L和 10 mg/L時達(dá)到最低值, 僅為對照組的57.1%, 在1 mg/L時達(dá)到最大值, 高于對照組157%。由圖7看出, Pb2+對葉綠素a含量影響較為明顯, 波動幅度較大, 0.1、0.2、0.3 mg/L和0.4 mg/L實驗組葉綠素a含量均小于對照組, 在0.3 mg/L時達(dá)到最小值, 僅為對照組的34.1%。

從圖8可知, 所有實驗組的葉綠素a含量均小于對照組, 1 mg/L組葉綠素a含量最低, 僅為對照組的37.5%。5 mg/L組葉綠素a含量為對照組的45.8%。說明Mn2+對中肋骨條藻葉綠素a合成起抑制作用。由圖9得知: 0.5 mg/L組葉綠素a含量最大, 高于對照組2.9%。其余4組葉綠素a含量均小于對照組, 其中0.1 mg/L組葉綠素a含量最小, 僅僅是對照組的17.6%。

0.1 mg/L組葉綠素a含量小于對照組, 為對照組的83.3%, 其余4組葉綠素a含量均大于對照組, 其中0.5 mg/L組的生長量高于對照組117%, 1 mg/L組葉綠素a含量最大, 為對照組5.8倍之多。Ba2+對中肋骨條藻葉綠素 a合成起很好的促進(jìn)作用, 結(jié)果見圖10。

圖6 中肋骨條藻葉綠素a含量對不同質(zhì)量濃度Cd2+的響應(yīng)Fig. 6 Response of the Chlorophyll a content in Skeletonema costatum to different Concentrations of

圖7 中肋骨條藻葉綠素a含量對不同質(zhì)量濃度Pb2+的響應(yīng)Fig. 7 Response of the Chlorophyll a content in Skeletonema costatum to different concentrations of Pb2+

3 討論

圖8 中肋骨條藻葉綠素a含量對不同質(zhì)量濃度Mn2+的響應(yīng)Fig. 8 Response of the Chlorophyll a content in Skeletonema costatum to different Concentrations of Mn2+

圖9 中肋骨條藻葉綠素a含量對不同質(zhì)量濃度的Li+響應(yīng)Fig. 9 Response of the Chlorophyll a content in Skeletonema costatum to different concentrations of Li2+

圖 10 中肋骨條藻葉綠素 a含量對不同質(zhì)量濃度 Ba2+的響應(yīng)Fig. 10 Response of the Chlorophyll a content in Skeletonema costatum to different concentrations of Ba2+

在生長方面, 5種金屬離子對中肋骨條藻的生長均有一定程度的脅迫作用, 5種金屬離子對中肋骨條藻的生長抑制作用強度順序: Cd2+>Pb2+>Mn2+>Li+>Ba2+。到第10天, Cd2+質(zhì)量濃度1、10 mg/L組生長量僅有對照組的59%及43.6%, 這與何學(xué)佳等[12]和周銀環(huán)等[13]的研究結(jié)果不一致, 原因有待于進(jìn)一步研究。0.5 mg/L的Cd2+對中肋骨條藻的抑制比較明顯, 這與張亞楠[14]等的研究一致, 這說明高質(zhì)量濃度的 Cd2+對藻類生長有明顯的抑制作用。培養(yǎng)至第7天, Pb2+質(zhì)量濃度0.1 mg/L組的生長量與對照組的生長量基本一致, 0.4 mg/L組的生長量為對照組的87.4%, 這與張瑩瑩等[15]研究的結(jié)果相一致。Mn2+質(zhì)量濃度0.1~5 mg/L時的生長量基本上均小于對照組,這與黃振芳[16]等研究的結(jié)果不一致, 可能是藻種遺傳屬性差異所致。到第10天, Ba2+2 mg/L組的生長量只有對照組的 69.4%, 這說明高質(zhì)量濃度的 Ba2+對中肋骨條藻有一定的抑制作用。

在葉綠素 a合成方面, 高質(zhì)量濃度的 Cd2+抑制葉綠素a的合成, 這與石磊等[17]的研究相一致。Mn2+質(zhì)量濃度為1 mg/L時葉綠素a含量最低, 僅為對照組的 37.5%, 5 mg/L組葉綠素 a含量為對照組的45.8%。由于Mn是葉綠體的結(jié)構(gòu)成分, 缺Mn會導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞, 甚至解體。但質(zhì)量濃度過高時,由于藻類細(xì)胞壁帶有負(fù)電荷和氨基—羥基等官能團(tuán),這些結(jié)構(gòu)特點決定了對帶有正電荷的金屬離子具有吸引富集的作用, Mn同細(xì)胞表面的O, S和N結(jié)合,生成穩(wěn)定的絡(luò)合物, 從而使細(xì)胞表面許多活性基團(tuán)喪失生物活性, 進(jìn)而抑制了藻細(xì)胞的光合作用和生長。Li+為0.1 mg/L時葉綠素a含量最小, 僅僅是對照組的17.6%, 而Ba2+為1 mg/L時葉綠素a含量最大, 為對照組5.8倍之多。5種金屬離子對中肋骨條藻的葉綠素 a抑制作用強度順序是 Mn2+>Li+>Pb2+>Cd2+> Ba2+。

本實驗采用了熱乙醇萃取分光光度法。丙酮法的測定過程比較繁雜, 其中樣品研磨需花費大量時間和精力, 且不容易將浮游植物細(xì)胞完全磨碎, 影響到葉綠素 a 的萃取效率。而乙醇法由于樣品經(jīng)過冷凍和快速熱水浴提取, 運用冷熱差以及超聲波的粉碎作用將浮游植物細(xì)胞破碎, 且熱溶液的萃取效果高于冷溶液, 對葉綠素a的萃取較完全, 且省時省力。不過, 過高的溫度會破壞葉綠素 a, 在操作時必須嚴(yán)格控制水浴溫度(80)℃和熱萃取時間(2 min), 防止過高溫度破壞葉綠素 a 而影響測定結(jié)果。另外乙醇對人體的毒害遠(yuǎn)小于丙酮, 長期使用丙酮萃取分光光度法對操作者的毒害較大, 所以使用熱乙醇萃取分光光度法比較合適。

[1] 倪學(xué)文. 海洋微藻應(yīng)用研究現(xiàn)狀與展望[J]. 海洋漁業(yè), 2005, 27: 251-255.

[2] 曾呈奎. 中國海藻的研究[A]//中國藻類學(xué)研究. 武漢:武漢出版社, 2001: 12-14.

[3] Terawaki T, Yoshikawa K, Yoshida G.. Ecology and restoration techniques for Sargassum beds in the Seto Inland Sea[J]. Japan J Mar Pollut Bull, 2003, 47:198-201.

[4] Chung I K, Kangy H, Yarish C, et al. Application of seaweed cultivation to the bio remediation of nutrient-rich effluent [J]. Algae, 2002, 17(3): 187-194.

[5] Avila M, Seguel M. An overview of seaweed resources in Chile [J]. J Appl Phycol, 1993, 5: 133-139.

[6] Troel M, Hallin G C, Nilsson A, et al. Integrated marine cultivation of Gracialria chilensis(Gracilariales,Rhodophyta) and salmon cages for reduced environmental impact and increased economic output [J]. A quaculture, 1997, 156: 45-61.

[7] Buschmann A H, Correa J A, Westermeier R, et al. Red algal farming in Chile: A review [J]. A quaculture, 2001,194: 203.

[8] Haglund K, Pedersen M. Out door pondcultivation of the subtropical marine red alga Gracilaria tenuistipitata in brackish water in Sweden.Growth, nutrient uptake, co-cultivation with rainbow trout and epiphytecontrol [J]. J Appl Phyco, 1993, 5: 271-284.

[9] Mcvey J P, Stickney R R, Yarish C, et al. Aquatic polyculture and balanced ecosystem management: New paradigms for seaweed production[A]//Responsible marine aquaculture [C]. NewYork: CABI Publishing,2002: 91-104.

[10] Wakibia J G, Anderson R J, Keats D W. Growth rates and agar properties of three gracilarioids in suspended open-water cultivation in St. Helena Bay, South Africa [J].J Appl Phyco, 2001, 13: 195-207.

[11] 陳宇煒, 高錫云. 浮游植物葉綠素a含量測定方法的比較測定[J]. 湖泊科學(xué), 2000, 12(2): 185-188.

[12] 何學(xué)佳, 彭興躍. 應(yīng)用流式細(xì)胞儀研究 Pb對海洋微藻生長的影響[J] . 海洋環(huán)境科學(xué), 2003 , 22 (1) : 1-5.

[13] 周銀環(huán), 劉東超. 4種微量元素對綠色巴夫藻生長、葉綠素a及大小的影響 [J] . 湛江海洋大學(xué)學(xué)報, 2003 ,23 (1) : 22-28.

[14] 張亞楠, 段舜山. 綠色巴夫藻的重金屬脅迫效應(yīng)及吸附能力的研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2003, 4: 18.

[15] 張瑩瑩, 王修林. Pb(Ⅱ)對海洋浮游植物生長的影響[J]. 海洋科學(xué), 2005, 6: 32-35.

[16] 黃振芳, 劉昌明. 鐵錳微量元素對淡水藻類的生長影響研究[J]. 北京師范大學(xué)學(xué)報, 2009, 45: 610.

[17] 石磊, 姜彬慧. 重金屬對小球藻的毒性作用及小球藻對Hg2+的吸附研究[J]. 河南科學(xué), 2008, 12: 30.

The stress effects of metal ions on Skeletonema costatum and the influences on chlorophyll a synthesis

WANG Hong-bin1,2, CHENG Ming3, QIAN Peng1, LI Shi-hu1, YAN Bin-lun2
(1. College of Marine Sciences, HuaiHai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China; 2.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Lianyungang 222005,China; 3. Lianyungang Rongsheng biotechnology Co.Ltd, Lianyungang 222005, China)

Dec.,12,2011

Skeletonema costatum; meta lions; stress; response

The responses of Skeletonema costatum to different concentrations of 5 metal ions stress and their influences on chlorophyll a synthesis in S. costatum were investigated. The results showed that S. costatum had significant responses to Cd2+and Ba2+. After 10-day culture, the growth of the 1 mg/L and 10 mg/L Cd2+groups was only 59% and 43.6% of the control group respectively. The S. costatum quantity in 2 mg/L Ba2+group was 69.4% of the control group.In contrast, the quantity of the 0.5 mg/L Ba2+group was 38.9% more than the control group . The stress effects of other metal ions were not significant. In terms of chlorophyll a synthesis, when the Cd2+concentration was 1 mg/L, the chlorophyll a quantity was the highest, which was 157% higher than the control group. With, the chlorophyll a quantities in 0.5 mg/L and 1 mg/L Ba2+groups were 116% and 483% higher than the control group. The other metal ions all inhibited chlorophyll a synthesis and the chlorophyll a quantities in all the other groups were lower than the control group. The chlorophyll a quantities of 0.3 mg/L Pb2+, 1 mg/L Mn2+and 0.1 mg/L Li+groups were very low and were only 34.1%、37.5% and 17.6% of control group. In summary, 0.5 mg/L Ba2+can promote the growth of S. costatum and its chlorophyll a synthesis and this is very important to the large scale culture of S. costatum.

X55

A

1000-3096(2012)07-0104-05

2011-12-12;

2012-02-13

國家星火計劃項目(2010GA690170)

王洪斌, (1966-), 男, 副教授, 理學(xué)碩士, 主要從事微生物學(xué)及基因工程的教學(xué)與科研工作, E-mail: whbvirus@126.com

(本文編輯：梁德海)