蔣鳳華, 高 偉, 趙美麗, 王 振, 鄭 立

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心, 山東 青島 266061; 2. 青島科技大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院, 山東 青島 266042)

原油污染對(duì)櫛孔扇貝抗氧化酶活性的影響

蔣鳳華1, 高 偉1, 趙美麗1, 王 振2, 鄭 立1

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心, 山東 青島 266061; 2. 青島科技大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院, 山東 青島 266042)

以原油水溶性成分(water soluble fraction of crude oil, WSF)為污染物, 采用暴露實(shí)驗(yàn)法, 研究了櫛孔扇貝(Chlamys farreri)鰓和消化腺組織中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)和過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性的變化。結(jié)果表明, WSF污染下, 鰓和消化腺組織SOD和CAT酶活性隨暴露時(shí)間增加一般表現(xiàn)為降低-升高-降低的趨勢, 酶活性達(dá)到最高的時(shí)間隨濃度不同而變化。第1天時(shí)消化腺SOD在0.08 mg/L濃度下被誘導(dǎo), 而后隨時(shí)間增加表現(xiàn)為抑制效應(yīng); 濃度為0.21和0.88 mg/L時(shí)消化腺SOD酶活性被抑制, 隨暴露時(shí)間延長而活性增加。暴露時(shí)間為4 d時(shí), 石油烴濃度在0.08和0.88 mg/L時(shí)鰓組織SOD酶活性均被抑制, 而濃度為0.21 mg/L時(shí)被誘導(dǎo)。消化腺和鰓組織SOD可以作為扇貝被污染脅迫的指標(biāo)。

原油水溶性組分; 櫛孔扇貝(Chlamys farreri); 酶活性; 超氧化物歧化酶; 過氧化氫酶

石油污染是目前海洋環(huán)境污染中最嚴(yán)重對(duì)海洋生物威脅最大的污染問題, 因此加強(qiáng)對(duì)海洋石油污染的監(jiān)測, 保護(hù)海洋生態(tài)環(huán)境已經(jīng)迫在眉睫。研究表明, 1996年–2005年間, 石油污染使我國渤海灣常見雙殼類種群增長率降低了 2.33%[1-2]。通過化學(xué)方法對(duì)石油烴進(jìn)行測定, 只能得到在海洋環(huán)境中石油烴濃度含量, 不能給出其生物利用率及對(duì)整個(gè)生物系統(tǒng)的影響效應(yīng)。應(yīng)用生物監(jiān)測方法, 可以獲得被選擇生物的系統(tǒng)參數(shù), 以此來反應(yīng)環(huán)境質(zhì)量或狀態(tài)的變化, 達(dá)到了解污染性質(zhì)、分析污染程度、追蹤污染發(fā)生的歷史、預(yù)測污染影響及發(fā)展趨勢的目的[3-4]。

目前, 抗氧化防御系統(tǒng)的變化作為指示污染物脅迫的生物標(biāo)志物已成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),在環(huán)境脅迫等逆境情況下, 生物體內(nèi)廣泛存在活性氧爆發(fā)現(xiàn)象而使自由基增多, 過量自由基會(huì)使以超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)和過氧化氫酶(Catalase, CAT)為主的抗氧化防御系統(tǒng)遭到破壞, 對(duì)細(xì)胞構(gòu)成氧化脅迫, 造成 DNA鏈斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶蛋白失活等氧化損傷。因此 CAT、SOD等酶活性的變化在一定程度上能反應(yīng)出機(jī)體在環(huán)境脅迫下抗氧化系統(tǒng)的變化, 可作為環(huán)境污染脅迫的指標(biāo)[5-7]。

國外許多學(xué)者對(duì)石油烴的海洋生態(tài)毒理學(xué)進(jìn)行了探討, 并對(duì)其富集機(jī)理和在生物體內(nèi)不同組織、器官間的分布、遷移、轉(zhuǎn)化等過程進(jìn)行了大量的研究。國內(nèi)學(xué)者對(duì)石油烴污染下魚體內(nèi)的抗氧化酶活性或重金屬離子脅迫下貝類體內(nèi)抗氧化酶活性的變化進(jìn)行了一些研究[8-9], 同時(shí)也研究了柴油水溶性組分脅迫下貝類體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化[10-11], 但原油水溶性組分對(duì)貝類的影響則鮮見報(bào)道。2010年墨西哥灣溢油、大連溢油以及2011年渤海溢油事件的發(fā)生, 使得如何對(duì)原油泄漏引起的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及損害評(píng)估進(jìn)行評(píng)價(jià)變得尤為重要。本文以重要經(jīng)濟(jì)貝類櫛孔扇貝(Chlamys farreri)為研究對(duì)象, 研究了扇貝體內(nèi)鰓和消化腺組織SOD和CAT酶對(duì)不同濃度原油水溶性組分(water soluble fraction of crude oil, WSF)污染的響應(yīng), 以期為海洋石油污染的生態(tài)評(píng)價(jià)及損害評(píng)估提供一些有價(jià)值的參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用櫛孔扇貝購自青島臺(tái)東南山市場, 洗凈后清除其體表附著生物, 在室溫下暫養(yǎng)于室內(nèi) 48 L盛有天然海水的塑料箱中, 連續(xù)充氣, 24 h換水。每天投喂金藻一次, 水溫為 18~20℃, 暫養(yǎng)一周, 待其狀態(tài)穩(wěn)定后, 選取活力好, 體長4~5 cm的個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 WSF溶液的制備及濃度測量

實(shí)驗(yàn)用原油取自天津中海油平臺(tái)。原油中含有數(shù)百種化合物, 主要由烷烴、芳香烴及環(huán)烷烴組成,約占原油含量的50% ~98%, 其余為非烴類含氧、含硫及含氮等化合物; 烷烴是組成原油的主要成分,主要含有直鏈烷烴以外, 還含有支鏈(異構(gòu))烷烴等;環(huán)烷烴帶 5~6個(gè)碳原子, 環(huán)狀排列, 占原油含量的30%~60%, 重要的小量組分為甾烷、萜烷類; 芳香烴占原油含量的2%~4%, 有單環(huán)芳烴(如苯、甲苯、二甲苯), 雙環(huán)芳烴(萘)、三環(huán)芳烴(如蒽和菲)以及多環(huán)烴(如苯并芘、苯并蒽、多核芳烴)等[12]。

原油與沙濾海水按1:10(V/V)混合, 超聲分散1 h,靜置4 h后吸取表層下水相即為母液, 母液置于棕色玻璃瓶中4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前稀釋。海水中石油烴含量按照海洋監(jiān)測規(guī)范[13]方法, 用Hitachi F-4500熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測量。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

選用體積為 50 cm×40 cm×35 cm 的玻璃水槽,分別加入不同體積WSF母液, 設(shè)置為對(duì)照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組, 實(shí)驗(yàn)溶液總體積30 L,測量各組實(shí)際濃度分別為 0.04、0.08、0.21和 0.88 mg/L。將櫛孔扇貝隨機(jī)分為4組, 每組40只扇貝, 充氣泵24 h充氣, 每日投喂100 mL金藻(密度為1×106~2×106個(gè)/mL)一次, 更換1/3體積相同濃度的實(shí)驗(yàn)溶液, 以使溶液濃度保持相對(duì)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)期間水溫18~20℃。

在污染實(shí)驗(yàn)開始的第0、1、2、4、7 天采樣, 7 d后將污染液全部換成清潔的沙濾海水進(jìn)行為期 3 d的恢復(fù)實(shí)驗(yàn), 每次采樣隨機(jī)選取3只扇貝。采樣時(shí)仔細(xì)分離出鰓和消化腺樣品, 用預(yù)冷超純水沖洗并用濾紙吸干水分后, 裝在鋁箔折成的小袋中, 稱重,–80℃保存。

1.4 樣品處理及測定

1.4.1 粗酶液的提取

以預(yù)冷磷酸緩沖液為提取液, 按照 1:9(W/V)比例, 先將1/3提取液加入組織研磨器進(jìn)行在冰浴中勻漿, 余下的2/3提取液沖洗組織研磨器, 合并勻漿液,5500 r/min, 4℃離心 30 min, 取上清液(粗酶液)–80℃保存至酶活性分析。

1.4.2 抗氧化酶活性和蛋白含量的測定

SOD、CAT活性測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒, 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定, 其活性單位定義為: 每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)單位。CAT采用可見光法測定, 其活性單位定義為: 每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 mmol的H2O2的量為一個(gè)活力單位。蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行測定。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)法將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異進(jìn)行 t-檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SEM), P<0.05被認(rèn)為差異顯著, P<0.01被認(rèn)為差異極顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SOD、CAT是廣泛存在于生物體中的抗氧化酶,在生物體各組織器官中都有分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 各濃度組扇貝體內(nèi)鰓組織中SOD、CAT酶活性一般低于消化腺組織, 主要原因在于消化腺中包含肝臟, 而肝臟是機(jī)體代謝解毒的主要器官, 因而酶活性較高, 這與其他無脊椎動(dòng)物類似, 與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的[10,14]。

2.1 原油污染對(duì)扇貝鰓組織 SOD和 CAT活性的影響

不同濃度WSF污染下櫛孔扇貝鰓組織SOD酶活性變化如圖 1所示?？梢? 實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組 SOD酶活性無顯著變化, 各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均存在顯著差異。第1 天時(shí)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組SOD酶活性均被抑制, 分別比對(duì)照組降低了25.9%、51.2%和29.0%。第2天各實(shí)驗(yàn)組SOD酶活性均較第1天有所升高, 低、高濃度組SOD酶活性分別高于對(duì)照組48.0%和31.5%,處于被誘導(dǎo)狀態(tài); 中濃度組則低于對(duì)照組28.0%。第4天時(shí)低、高濃度組 SOD酶活性降低, 處于被抑制狀態(tài), 分別較對(duì)照組降低了 23.9%和 26.2%; 而中濃度組則被誘導(dǎo)。時(shí)間延長至第 7天時(shí), 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組SOD酶活性均被顯著抑制, 分別為對(duì)照組的34.5%、36.4%和 66.3%, 且隨 WSF濃度增加抑制率也增加,呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系。3 d恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后(第10天), 低濃度組SOD酶活性升高為對(duì)照組的114%, 而中、高濃度組 SOD酶活性仍然被抑制, 分別只有對(duì)照組的35.3%和36.0%, 表明低濃度WSF下脅迫7 d, 鰓組織SOD酶活性可恢復(fù), 隨WSF濃度增大SOD酶活性則不能恢復(fù)。從時(shí)間梯度上比較, 實(shí)驗(yàn)組SOD活性有降低-升高-降低的趨勢, 酶活性達(dá)到最高的時(shí)間隨WSF濃度不同而不同。

圖1 原油水溶性組分對(duì)櫛孔扇貝鰓組織SOD酶活性的影響Fig. 1 Effects of WSF of crude oil on SOD activity in the gill of Chlamys farreri與對(duì)照組相比, *: 顯著差異, 0.01

圖 2為不同濃度 WSF污染下櫛孔扇貝鰓組織CAT酶活性的變化?？梢? 實(shí)驗(yàn)期間各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較均表現(xiàn)為抑制效應(yīng), 并且第 7天時(shí)酶活性最高。第1天時(shí)低、中濃度組CAT酶活力與對(duì)照組之間存在顯著差異(P<0.01)。第 2天時(shí)中濃度組CAT酶活力最低, 與對(duì)照組之間存在顯著差異(0.01

2.2 石油污染對(duì)消化腺 SOD和 CAT酶活性的影響

圖2 原油水溶性組分對(duì)櫛孔扇貝鰓組織CAT酶活性的影響Fig. 2 Effects of WSF of crude oil on CAT activity in the gill of Chlamys farreri與對(duì)照組相比, *: 顯著差異, 0.01

圖 3 原油水溶性組分對(duì)櫛孔扇貝消化腺 SOD酶活性的影響Fig. 3 Effects of WSF of crude oil on SOD activity in the digestive gland of Chlamys farreri與對(duì)照組相比, *: 顯著差異, 0.01

圖3 為不同濃度WSF污染下櫛孔扇貝消化腺組織SOD酶活性隨時(shí)間的變化?？梢? 第1天時(shí)低濃度組 SOD酶被顯著誘導(dǎo), 高于對(duì)照組 24.0%; 中濃度組SOD酶活性被抑制, 但與對(duì)照組之間無顯著差異; 高濃度組 SOD酶活性則被極顯著抑制, 低于對(duì)照組24.0%。第2天時(shí), 低濃度組和高濃度組的抑制率分別為 24.0%和 25.7%, 與對(duì)照組之間差異顯著;中濃度組SOD酶活性與對(duì)照組之間無顯著差異。第4天時(shí)各實(shí)驗(yàn)組 SOD酶活性均表現(xiàn)為抑制, 但與對(duì)照組之間無顯著差異。第 7天時(shí)低濃度組和中濃度組SOD酶活性分別為對(duì)照組的84.8%和65.0%, 表現(xiàn)為抑制效應(yīng); 高濃度下則表現(xiàn)為誘導(dǎo)效應(yīng), SOD酶活性升高 8.8%, 但只有中濃度組與對(duì)照組之間存在顯著差異。總之, 隨暴露時(shí)間增加, 低濃度 WSF脅迫下消化腺 SOD酶活性表現(xiàn)為升高-降低的變化趨勢,對(duì)SOD酶有誘導(dǎo)-抑制作用; 而中、高濃度WSF脅迫下, SOD酶活性表現(xiàn)為降低-升高的趨勢, 有抑制-誘導(dǎo)作用, SOD酶活性達(dá)到最高的時(shí)間隨WSF濃度不同而不同。3 d恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后, 各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均處于抑制狀態(tài), 且低、中濃度組與對(duì)照組之間存在顯著差異。

由圖4可見, 實(shí)驗(yàn)期間, 低、中濃度組CAT酶活性與對(duì)照相比均被抑制, 且第2天活性最高, 低濃度組在第 7天時(shí)與對(duì)照組之間差異顯著, 而中濃度組在第 1 天和第 7天與對(duì)照組之間差異顯著; 并且第7天時(shí)抑制率最大, 達(dá)76.0%。高濃度組CAT酶活性在第1天和第2天被抑制, 抑制率分別為48.1%和22.1%, 第4天和第7天則表現(xiàn)為誘導(dǎo)效應(yīng), 分別為對(duì)照組的121%和104%, 但只有第1天和第7天時(shí)與對(duì)照組之間存在顯著差異。從時(shí)間梯度上看, 低、中濃度組CAT酶活性表現(xiàn)為降低-升高-降低的趨勢,而高濃度組表現(xiàn)為降低-升高的變化, 如果污染脅迫時(shí)間進(jìn)一步延長, 可能會(huì)出現(xiàn)降低的趨勢。3 d恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后, 低濃度和中濃度下CAT酶活性相對(duì)于對(duì)照組有所提高, 高濃度下 CAT酶活性有所降低,分別為對(duì)照組的113%、95%和126%, 但均與對(duì)照組之間無顯著差異。

圖4 原油水溶性組分對(duì)櫛孔扇貝消化腺CAT酶活性的影響Fig. 4 Effects of WSF of crude oil on CAT activity in the digestive gland of Chlamys farreri與對(duì)照組相比, *: 顯著差異, 0.01

3 討論

石油烴可改變磷脂脂肪酸的構(gòu)成, 其中的多環(huán)芳烴可與芳烴受體結(jié)合, 進(jìn)而影響相關(guān)酶的活性[15]。目前公認(rèn)的石油污染的生物標(biāo)志物是細(xì)胞色素 P450和DNA加合物[16]。但由于石油烴在生物體內(nèi)代謝時(shí)往往伴隨產(chǎn)生大量自由基, 因此, 抗氧化系統(tǒng)也有可能作為石油污染的生物標(biāo)志物, 關(guān)于這方面的研究正越來越引起各國學(xué)者的興趣。研究表明, 石油的毒性作用機(jī)制主要是石油代謝中產(chǎn)生的自由基對(duì)免疫細(xì)胞如吞噬細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用, 影響了雙殼類的免疫功能[9]。

研究發(fā)現(xiàn), 綠貽貝肝臟組織SOD活性與體內(nèi)多氯聯(lián)苯含量顯著相關(guān)[5], 僧帽牡蠣消化腺和鰓的SOD、CAT活性與體內(nèi)石油烴含量均有良好的正相關(guān)性[10]。研究證實(shí), 當(dāng)生物體受到輕度逆境脅迫時(shí),SOD、CAT活性往往升高, 認(rèn)為是生物體對(duì)污染的適應(yīng)性反應(yīng), 主要是增強(qiáng)機(jī)體消除活性氧自由基的能力; 而當(dāng)受到重度逆境脅迫時(shí), SOD、CAT活性通常降低, 是污染物對(duì)生物體的作用已超過機(jī)體的適應(yīng)能力, 從而導(dǎo)致生物體的傷害[10,17]。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, WSF污染下, 櫛孔扇貝鰓和消化腺組織SOD和CAT酶活性隨暴露時(shí)間的增加, 一般表現(xiàn)為降低-升高-降低的趨勢, 酶活性達(dá)到最高的時(shí)間隨濃度不同而變化。魯雙慶等[18]研究發(fā)現(xiàn), 隨暴露時(shí)間的增加, Cu污染下, 黃鱔肝臟保護(hù)酶GPx(谷胱甘肽過氧化物酶)、CAT和 SOD的活性影響同樣整體表現(xiàn)為“抑制-誘導(dǎo)-抑制”的規(guī)律。暴露時(shí)間為4 d時(shí), 在低(0.08 mg/L)、高(0.88 mg/L)濃度WSF污染脅迫下鰓組織SOD酶活性均被抑制, 而在中濃度(0.21 mg/L)下被誘導(dǎo)。櫛孔扇貝暴露于Cu溶液10 d后, 隨Cu質(zhì)量濃度的增加, 內(nèi)臟團(tuán)SOD、CAT、GPx活性表現(xiàn)出同樣表現(xiàn)為“抑制-誘導(dǎo)-抑制”的規(guī)律[19]。脫氧鬼臼毒素對(duì)斑馬魚肌肉組織SOD酶活性的影響, 同樣在0.5 mg/L存在抑制作用, 在1.0和 2.0 mg/L時(shí)具有誘導(dǎo)作用, 而達(dá)到 4.0 mg/L時(shí)SOD和CAT活性均被顯著抑制[9]。由此可見, 本文研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),扇貝體內(nèi)鰓和消化腺組織SOD、CAT酶均發(fā)生變化,消化腺和鰓組織 SOD可以作為扇貝被污染脅迫的指標(biāo)。致謝: 感謝中國海監(jiān)總隊(duì)業(yè)務(wù)化經(jīng)費(fèi)“海洋石油勘探開發(fā)溢油檢驗(yàn)鑒定執(zhí)法業(yè)務(wù)化運(yùn)行系統(tǒng)-海洋溢油損害評(píng)估”的支持。

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Effect of crude oil on the activity of antioxidant enzyme of scallop Chlamys farreri

JIANG Feng-hua1, GAO Wei1, ZHAO Mei-li1, WANG Zhen2, ZHENG Li1
(1. Research center of Marine Ecology, The First Institute of Oceanography, State Ocean Administration (SOA),Qingdao 266061, China; 2 .College of Chemistry and Molecular Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)

May, 5, 2011

water soluble fraction (WSF) of crude oil; Chlamys farreri; activity of enzyme; Super Oxide Dismutase (SOD);Catalase (CAT)

The toxic effects of water soluble fraction (WSF) of crude oil on scallop Chlamys farreri were examined through exposure tests at different concentrations. The activities of antioxidases in gill and digestive glands were examined. The results showed that the activities of both SOD (Superoxide Dismutase) and CAT (Catalase) in gills and digestive glands showed a decrease-increase-decrease trend with increased exposure time. Time for the enzymes to reach their highest activities varied with the concentration of WSF. The activity of SOD in digestive gland was induced by 0.08 mg/L of WSF on the 1stday of exposure, followed by inhibitory effect. The digestive gland enzyme activities were inhibited first and then increased with time at 0.21 mg/L and 0.88 mg/L of WSF. At the 4thday of the test, the activities of SOD in gills gland were inhibited by both 0.08 and 0.88mg/L of WSF but induced by 0.21 mg/L of WSF. Our study indicated that the SOD activity could be used as a stress indicator of Chlamys farreri when exposed to petroleum polluted environments.

X171.5

A

1000-3096(2012)07-0028-06

2011-05-05;

2012-02-12

海洋公益性課題(200705011, 201105013); 北海區(qū)海洋環(huán)境質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)項(xiàng)目(DOMEP (MEA)-01-01-C); 國家海洋局第一海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2010T04); 國家海洋局青年海洋科學(xué)基金項(xiàng)目(2012534)

蔣鳳華(1977-), 女, 漢, 山東德州人, 副研究員, 主要從事海洋環(huán)境污染評(píng)價(jià)方向研究, 電話 0532-88962711, E-mail: jiangfh@fio.org.cn; 鄭立, 通信作者, 電話 0532-88961802, E-mail:zhengli@fio.org.cn

(本文編輯：康亦兼)