張金鈴，崔 巍，吉長福，崔山佳，孫海舒，張守信，蔣 瑾，羅明富、4△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院北京北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029;3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700)

胃潰瘍的患病率為5% ～10%［1-2］，目前西醫(yī)治療主要采用殺滅幽門螺旋桿菌及抑制胃酸等措施，近期效果好，停藥后復(fù)發(fā)率高［3］且副作用多，價格貴。針灸治療該病副作用小，有廣泛的治療應(yīng)用前景，但機制尚不明確，故本實驗就針與灸治療胃潰瘍模型大鼠的異同為切入點，進(jìn)一步摸索針灸作用的機理。通過細(xì)胞培養(yǎng)及活細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子Fluro-3分子探針標(biāo)記，觀察針與灸的細(xì)胞分子水平作用機制，從而分析肥大細(xì)胞的功能活動與針灸作用的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 造模

大鼠損傷性胃潰瘍模型制備方法的具體操作:注射器去針頭，在連接針頭處安裝細(xì)銅管，將配制好的HCL吸入注射器中，銅管沿大鼠食管插入胃中后緩慢推入藥物，用于造成胃黏膜急性損傷。

1.2 制備血清

血清的無菌操作制備改良方法:將大鼠腹主動脈暴露，選取普通型10ml靜脈取血管，將靜脈針插入腹主動脈后，按住末端插入無菌一次性取血管取血，靜置40min后離心吸取血清到無菌管中，凍存于－20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 針與灸的施治方法

取足三里和胃腧穴;電針1mA，頻率2/15Hz，每次20min，連續(xù)3d;艾灸同樣取足三里和胃腧穴每次每穴2柱，連續(xù)3d。

1.4 分組

實驗分為正常對照組、胃潰瘍模型組、針刺模型組、艾灸模型組4組。取4組大鼠血清分別加入培養(yǎng)的肥大細(xì)胞皿中，作用12h和24h后，采用Fluro-3分子探針標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光值變化，從而動態(tài)分析探索針灸穴位作用于經(jīng)絡(luò)皮部的機制。

2 結(jié)果

2.1 針與灸血清作用于培養(yǎng)的肥大細(xì)胞12h后的效應(yīng)觀察

表1顯示，加入模型組血清后細(xì)胞內(nèi)熒光值升高，與正常組比較差異有顯著性(P＜0.01)，可見潰瘍使細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，出現(xiàn)了鈣超載的現(xiàn)象，模型成功。而針刺組與模型組比較，肥大細(xì)胞內(nèi)熒光值明顯下降(P＜0.01)，說明針刺潰瘍模型大鼠細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度沒有上升;艾灸組與模型組比較差異顯著(P＜0.01)，說明潰瘍大鼠施艾灸后，肥大細(xì)胞內(nèi)未出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象。艾灸與針刺差異不顯著。

2.2 針與灸血清對肥大細(xì)胞作用24h后的效應(yīng)觀察

表2顯示，加入血清24h后，模型組與正常組比較未見明顯差異(P＞0.05)，針刺組和艾灸組與模型組比較差異亦不顯著，說明針與灸血清24h時對肥大細(xì)胞沒有表現(xiàn)出調(diào)節(jié)作用，針灸作用可能有時間窗口限制。

表1 加入針與灸血清12h對培養(yǎng)肥大細(xì)胞鈣超載的阻抑作用(珋x±s)

表2 針與灸血清加入24h后對培養(yǎng)肥大細(xì)胞內(nèi)鈣含量的調(diào)節(jié)作用(珋x±s)

3 討論

RBL-2H3是1978年美國國立牙科研究所的免疫學(xué)實驗室從Wistar大鼠嗜堿性細(xì)胞中分離和克隆出來的細(xì)胞株。這些細(xì)胞具有高親和力的IgE受體。通過集聚這些受體或與鈣離子載體協(xié)同作用可以激活它們分泌組胺及其他遞質(zhì)。這株細(xì)胞廣泛地用于研究細(xì)胞分泌的不同方面，包括細(xì)胞內(nèi)鈣濃度改變、磷酸脂酶激活、蛋白激酶和小 G蛋白的作用［4、5］。肥大細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞一旦被激活即釋放其預(yù)先合成和新產(chǎn)生的介質(zhì)如組胺、IL-4等細(xì)胞因子，從而在生理和病理條件下參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分泌和遷移等。有研究顯示，IL-12不能刺激肥大細(xì)胞分泌IL-6，但能通過激活ERK信號傳導(dǎo)通路實現(xiàn)刺激肥大細(xì)胞分泌 IL-13［6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞胞質(zhì)鈣離子濃度升高并持續(xù)穩(wěn)定在最大值平臺時能夠獲得最佳的脫顆粒率。也就是說，細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高后可促使肥大細(xì)胞脫顆粒。電針和手針實驗同樣發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象［8、9］。穴位區(qū)肥大細(xì)胞參與了激光針灸鎮(zhèn)痛效應(yīng)，而肥大細(xì)胞的脫顆?，F(xiàn)象是產(chǎn)生此效應(yīng)的一個重要環(huán)節(jié)，肥大細(xì)胞可由不同途徑激活而產(chǎn)生相似效應(yīng)［10］。本課題采用體外培養(yǎng)活細(xì)胞的方法，研究針灸作用后的組織液血清直接作用于培養(yǎng)的肥大細(xì)胞并觀察鈣離子的變化，從而直觀地探討針灸的作用機制是否為通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度來發(fā)揮功能。

熒光分子探針Fluo-3AM是以鈣的螯合劑EDTA為基礎(chǔ)合成的，其乙酰羥甲基酯(AM)形式無熒光，游離態(tài)也無熒光。Fluo-3AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，F(xiàn)luo-3AM的熒光非常弱，其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。Fluo-3AM進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3AM可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合后熒光強度可增強50～100倍，因此Fluo-3AM可以反映出鈣離子濃度。既往神經(jīng)細(xì)胞實驗表明，其可作為顯示細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的理想標(biāo)記物［10、11］。Fluo-3AM 的常用濃度為 0.5～5μmol/L，通常用含有0.5～5μmol/L的 Fluro-3AM溶液和細(xì)胞一起于20℃ ～37℃孵育15min進(jìn)行熒光探針裝載。隨后適當(dāng)洗滌，洗滌后可以考慮適當(dāng)再孵育以確保分子探針在細(xì)胞內(nèi)完全轉(zhuǎn)變成Fluro-3，然后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。每個樣本檢測10000個狀態(tài)良好的活細(xì)胞，以增加結(jié)果的可靠性與穩(wěn)定性。

近來文獻(xiàn)報道，肥大細(xì)胞敏化后，刺激細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，會引起細(xì)胞膜通透性增加，進(jìn)一步引起細(xì)胞脫顆粒、合成細(xì)胞因子并釋放引起周圍組織和器官發(fā)生炎癥反應(yīng)［12～14］。肥大細(xì)胞(MC)是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)速發(fā)相的主要靶細(xì)胞，也是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性炎癥的主要啟動細(xì)胞［14］?？梢?，肥大細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)是機體的一種防御反應(yīng)，也是速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和炎癥等病理反應(yīng)的基礎(chǔ)［15］。然而肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的炎癥因子又可激活臨近的肥大細(xì)胞脫顆粒，啟動脫顆粒的自身放大機制［15、16］，引起更大范圍的炎癥反應(yīng)，它的過度應(yīng)激會導(dǎo)致組織損傷。本實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)的肥大細(xì)胞加入損傷性胃潰瘍模型大鼠血清12h后，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子升高，可能是損傷性胃潰瘍大鼠的血清中含有某些應(yīng)激活性因子，促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，從而引起肥大細(xì)胞脫顆粒等反應(yīng)。而針與灸作用于損傷性胃潰瘍模型大鼠后，使血清中產(chǎn)生了某種分子拮抗胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，從而抑制細(xì)胞膜通透性增加的通路，阻抑了肥大細(xì)胞脫顆粒的自放大功能，減輕過度炎癥反應(yīng)。但是加入血清24h后，針與灸血清的阻抑肥大細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高的作用沒有發(fā)揮出來，說明針與灸的作用可能有時間窗口限制。

本實驗通過血清學(xué)方法深入探索活細(xì)胞狀態(tài)下針灸對離體肥大細(xì)胞內(nèi)鈣離子的效應(yīng)規(guī)律，直觀地探索針灸的肥大細(xì)胞內(nèi)鈣通路效應(yīng)機理，對揭示針與灸的細(xì)胞內(nèi)鈣信號作用通路提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，對進(jìn)一步解釋經(jīng)絡(luò)實質(zhì)及經(jīng)穴組織物質(zhì)激活路徑及物質(zhì)交換機理有重要意義。

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