柴 旺，何小鵑，朱軍璇，呂 誠(chéng)，趙宏艷，呂愛(ài)平，喻長(zhǎng)遠(yuǎn)△

(1.北京化工大學(xué)，北京 100029;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;3.西南交通大學(xué)，成都 610031;4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

中藥材黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，具有升陽(yáng)固表、補(bǔ)中益氣、托毒生肌、利水退腫之功效，黃芪多糖是黃芪中重要的有效活性成分［1］。目前研究結(jié)果表明，黃芪多糖能夠有效提高機(jī)體的非特異性和特異性免疫功能，并可通過(guò)調(diào)節(jié)整體細(xì)胞免疫功能、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)具有殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子等方面，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用［2］。近年來(lái)，黃芪多糖抗腫瘤免疫機(jī)制的研究主要集中在激活和促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及輔助性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化等方面，但對(duì)髓樣抑制細(xì)胞(MDSC)調(diào)節(jié)和影響方面的研究較少［3］。為此，本實(shí)驗(yàn)擬以B16-F10荷瘤小鼠作為研究對(duì)象，通過(guò)觀察黃芪多糖對(duì)荷瘤鼠髓樣抑制細(xì)胞免疫活性的影響，探討黃芪多糖在抗腫瘤免疫機(jī)制方面所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)雄性 C57BL/6小鼠，體重 20g～22g，50只(中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證 SCXK-(軍)2007-004);黑色素瘤B16-F10細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院);RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó) Gibcol公司);胎牛血清(美國(guó) Gibcol公司);雙抗(美國(guó) Sigma公司);0.05%胰蛋白酶 +0.25%乙二胺四乙酸(0.05%trypsin+0.25%EDTA)(美國(guó) Gibcol公司);磷酸鹽緩沖液(PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);注射用環(huán)磷酰胺環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);黃芪多糖(Astragalus Polysaccharides，APS，天津賽諾制藥有限公司);FITC anti-mouse Ly-6G/Ly6c(Gr-1)抗體(BioLegend公司);PE anti-mouse CD11b抗體(BioLegend公司);Mouse IL-10 platinum ELISA(eBioscience公司);Mouse VEGF-A platinum ELISA(eBioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 B16-F10 細(xì)胞培養(yǎng) B16-F10(小鼠黑色素瘤)細(xì)胞株，消化液(0.05%trypsin+0.25%EDTA)消化后，傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境:RPMI 1640完全培養(yǎng)基(RPMI 1640+10%FBS)，37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱。采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16-F10細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 B16-F10荷瘤鼠模型的建立 將50只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、環(huán)磷酰胺組(CTX)、黃芪多糖組、黃芪多糖 +CTX組5組。造模方法:將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的B16-F10細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 4×106個(gè)/mL，以每只 0.1mL接種于C57BL/6小鼠右側(cè)背部皮下。造模后第2天開(kāi)始給藥。正常組和模型組:生理鹽水，0.2mL/只灌胃給藥;CTX 組:10mg/kg，0.2mL/只腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)給藥7d;黃芪多糖組:150mg/kg，0.2mL/只灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥14d;黃芪多糖 +CTX組:按150mg/kg黃芪多糖 每只0.2mL灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥14d，同時(shí)按10mg/kg CTX，每只0.2mL腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)給藥7d。每3d稱量各組小鼠腫瘤大小。第15天處死全部小鼠。采取眼球取血法，收集 C57BL/6小鼠血液，600g離心20min，收集血清，于-80℃低溫冰箱保存;脫頸處死小鼠，取脾臟制備單細(xì)胞懸液，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè);取腫瘤，根據(jù)公式“抑瘤率 =(生理鹽水對(duì)照組瘤體稱重－藥物組瘤體稱重)÷生理鹽水對(duì)照組瘤體稱重×100%”，計(jì)算抑瘤率。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟 Gr-1+CD11b+髓樣抑制細(xì)胞比例 將脾臟剪碎用200目濾布過(guò)濾，1000r/min離心8min。將所得細(xì)胞加入2mL裂紅液進(jìn)行破紅，1min后加入 PBS終止。選擇1100r/min離心8min。調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107個(gè)/mL，取出100μL至EP管，用 PBS洗滌2次后，將細(xì)胞重懸于100μLPBS中，加入 FITC anti-mouse Ly-6G/Ly6c(Gr-1)抗體和PE anti-mouse CD11b抗體，避光4℃孵育30min。再用PBS洗滌細(xì)胞3次，最后將細(xì)胞重懸于500μLPBS中，上機(jī)檢測(cè) Gr-1+CD11b+髓樣抑制細(xì)胞比例。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清 IL-10、VEGF含量 使用eBioscience公司的IL-10(白介素-10)、VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中IL-10、VEGF含量。測(cè)定方法分別參照對(duì)應(yīng)試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以珋x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖對(duì)B16-F10荷瘤小鼠抑瘤率的影響

黃芪多糖和CTX均能顯著抑制荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)。CTX、黃芪多糖、黃芪多糖+CTX組的抑瘤率分別為 68.73% 、75.2% 、79.78% 。

2.2 黃芪多糖對(duì)脾臟 Gr-1+CD11b+髓樣抑制細(xì)胞的影響

表1顯示，與正常組相比，模型組的脾臟Gr-1+CD11b+髓樣抑制細(xì)胞比例顯著升高(P＜0.01);與模型組相比，CTX、黃芪多糖、黃芪多糖+CTX治療均可以顯著降低脾臟Gr-1+CD11b+髓樣抑制細(xì)胞比例(P＜0.01)。

表1 黃芪多糖對(duì)脾臟Gr-1+CD11b+髓樣抑制細(xì)胞的影響

2.3 黃芪多糖對(duì) B16-F10荷瘤鼠血清 IL-10、VEGF含量的影響

表2顯示，與正常組相比，模型組的荷瘤鼠血清中分泌的IL-10和VEGF顯著升高(P＜0.01);與模型組相比，CTX組、黃芪多糖組、黃芪多糖+CTX組的B16-F10荷瘤鼠血清中分泌的 IL-10、VEGF顯著下降，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

表2 黃芪多糖對(duì)B16-F10荷瘤鼠血清IL-10、VEGF含量的影響

3 討論

黃芪性溫，味甘淡，有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、排膿、托瘡生肌的功效［4］。黃芪多糖是黃芪中的主要活性成分，有提高機(jī)體免疫功能、抗病毒等作用［2］。近年來(lái)，黃芪多糖的抗腫瘤免疫機(jī)制得到了廣泛研究［4］。研究表明，黃芪多糖可通過(guò)多種方式起到抗腫瘤的作用［3］。首先，黃芪多糖可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞，刺激其釋放 TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子，發(fā)揮抗腫瘤作用［5］;其次，黃芪多糖可通過(guò)刺激 DC成熟，進(jìn)而激活混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和抗原特異性細(xì)胞毒性T(CTL)反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤作用［6］;再次，黃芪多糖可通過(guò)提高NK數(shù)量和活性、促進(jìn) Th細(xì)胞轉(zhuǎn)化、使T細(xì)胞亞群恢復(fù)平衡的機(jī)制，起到抗腫瘤作用［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪多糖可有效提高B16-F10荷瘤鼠的抑瘤率，抑制腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步印證了黃芪多糖的抗腫瘤免疫活性。

腫瘤免疫耐受機(jī)制是造成腫瘤疫苗沒(méi)有較好療效的原因之一，目前已經(jīng)得到了人們廣泛關(guān)注［8］。腫瘤組織中聚集著一群異質(zhì)細(xì)胞，包括未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，其共同的表面標(biāo)志為Gr-1+CD11b+，這群細(xì)胞被稱為髓樣抑制細(xì)胞(Myeloid de-rived suppressor cells，MDSC)，是引起腫瘤免疫逃逸的重要細(xì)胞群體［9］。IL-10是一種重要的免疫抑制因子，可通過(guò)對(duì)多種效應(yīng)細(xì)胞和效應(yīng)分子的抑制以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用來(lái)抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫，其作用包括抑制巨噬細(xì)胞功能、抑制 T淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子合成等［10］。VEGF是由某些腫瘤細(xì)胞分泌而來(lái)，不但可誘導(dǎo)新生毛細(xì)血管生成，為實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，而且可直接促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，與實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［11］。MDSC可分泌 TGF-β、IL-10等抑制性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+Fox p3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞，抑制機(jī)體免疫［12］，此外，MDSC與 VEGF的分泌有密切關(guān)系，MDSC可聚集在血管周?chē)?，并促進(jìn)VEGF分泌，進(jìn)而促進(jìn)實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［13］。近年來(lái)，對(duì)黃芪多糖的抗腫瘤免疫機(jī)制主要集中在巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、Th細(xì)胞等方面［3］，而對(duì)髓樣抑制細(xì)胞(MDSC)的影響報(bào)道甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可抑制B16-F10荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)，脾臟內(nèi)Gr-1+CD11b+MDSC比例顯著下降，同時(shí)顯著抑制荷瘤鼠血清中 IL-10、VEGF釋放。提示:黃芪多糖可能通過(guò)抑制MDSC產(chǎn)生及其相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，從而減緩腫瘤所產(chǎn)生的免疫逃逸現(xiàn)象，同時(shí)抑制VEGF的分泌，阻斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)供給，抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

綜上，適當(dāng)濃度的黃芪多糖可通過(guò)降低 MDSC的比例，抑制相關(guān)細(xì)胞因子 IL-10及VEGF的分泌來(lái)發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

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