李春雷，李志浩，劉 菁，李 鵬，鄭 芳，朱雪松

胃癌的發(fā)生發(fā)展與其生理位置有密切關(guān)系。首先，胃癌細(xì)胞的微環(huán)境(胞外低pH值、低氧濃度、高葡萄糖吸收等)，尤其是酸性微環(huán)境對胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、胃癌細(xì)胞對放化療的敏感性有著重要影響［1］。其次，人胃腸道正常組織分泌的生長激素釋放抑制素(Somatostatin，SST，生長抑素)的含量變化可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［2］，而且SST在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中顯示出抗腫瘤作用［3-4］。在腫瘤微酸環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子中，V型ATP酶發(fā)揮了重要作用，而質(zhì)子泵抑制劑可顯著抑制V型ATP酶，發(fā)揮抗腫瘤作用［1］。同時(shí)，質(zhì)子泵抑制劑還可通過降低V型ATP酶的活性而減弱腫瘤的酸化，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的發(fā)生［5］。奧曲肽(Octreotide，OCT)是體外合成的生長抑素八肽類似物，具有比天然SST血漿半衰期長、作用更強(qiáng)大、耐受性好等優(yōu)點(diǎn)［6-7］，與胃部腫瘤相關(guān)生長抑素受體有很好的親和力。本文選擇不同抗腫瘤機(jī)制的非細(xì)胞毒藥物-奧曲肽和質(zhì)子泵抑制劑-奧美拉唑共同作用于胃癌細(xì)胞，研究聯(lián)合用藥對胃癌細(xì)胞的影響，探討其抗腫瘤效應(yīng)，以期為臨床胃癌化療中的聯(lián)合用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞，我院肝病分子實(shí)驗(yàn)中心保存。

1.1.2 主要試劑 RPM11640培養(yǎng)基;胎牛血清(標(biāo)準(zhǔn)級)和0.25%胰蛋白酶(BOSTER公司);奧美拉唑(魯南制藥)，奧曲肽(諾華制藥)，碘化丙啶和MTT(Sigma公司)，小牛血清(杭州四季青生物材料研究所)。

1.1.3 主要設(shè)備 二氧化碳恒溫箱、超凈臺(tái)、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、96孔板，流式細(xì)胞分析儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞置含有5%胎牛血清 RPM11640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的飽和濕度下培養(yǎng)，1～2d換1次液，3d左右傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞試驗(yàn)。

1.2.2 奧曲肽和奧美拉唑?qū)θ宋赴┘?xì)胞SGC-7901生長的影響 選擇對數(shù)生長期胃癌SGC-7901細(xì)胞，常規(guī)消化后制成單細(xì)胞混懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/L，接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μL/孔，37 ℃、5%CO2的飽和濕度下培養(yǎng)24 h后，換為無血清的 RPMI164O液培養(yǎng)，孵育24 h后將細(xì)胞分為6組。空白組:無細(xì)胞，只有培養(yǎng)液;對照組:培養(yǎng)液不加藥物;奧曲肽組:不同濃度奧曲肽;奧美拉唑組:不同濃度奧美拉唑;聯(lián)合用藥組:不同濃度奧曲肽+奧美拉唑。其中奧曲肽和奧美拉唑設(shè)5個(gè)濃度段，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。上述各組培養(yǎng)24 h后加入MTT繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入DMSO，振蕩溶解，于酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測定各孔吸光度值(A)，計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(對照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對照組A值×100%。

1.2.3 采用中效原理判斷奧曲肽與奧美拉唑聯(lián)合用藥的作用效果 抑制率(fa)=1-(實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值)。根據(jù)中效方程式fa/fu=(D/Dm)m(fu為腫瘤細(xì)胞存活率，fu=1-fa;D為藥物濃度;Dm為中效濃度，即fa達(dá)到0.5效應(yīng)時(shí)的藥物濃度)，方程兩邊取對數(shù):log(fa/fu)=mlogD-mlogDm。設(shè) y=log(fa/fu)，x=logD，a=-mlogDm(m為斜率，設(shè)m=b)，得直線方程:y=bx+a。計(jì)算出兩種藥物單用及合用時(shí)各自的中效濃度Dm(logDm=-a/b)，然后計(jì)算兩藥合用時(shí)在各種效應(yīng)時(shí)的合用指數(shù)(CI)=D1/Dx1+D2/Dx2+αD1D2/Dx1Dx2，D1、D2為合用時(shí)產(chǎn)生 X 效應(yīng)時(shí)兩藥各自所需的濃度，Dx1、Dx2為兩藥單用時(shí)產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)各自的濃度(α=1表示兩種藥物為相互非排斥性藥物，α=0表示兩種藥物為相互排斥性藥物)。CI＜1為協(xié)同，CI=1為相加，CI＞1為拮抗。

1.2.4 奧曲肽和奧美拉唑?qū)θ宋赴㏒GC-7901細(xì)胞周期的影響 選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化計(jì)數(shù)后，以RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為107/L，接種6孔培養(yǎng)板中，每孔 2 mL，于37℃、5%CO2的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，分組給藥。選擇上述MTT實(shí)驗(yàn)中的中效濃度作為實(shí)驗(yàn)終濃度，單獨(dú)和聯(lián)合作用于SGC-7901細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后常規(guī)收集各組細(xì)胞，離心，去上清，加70%的預(yù)冷乙醇(4℃)，于4℃冰箱固定過夜，PBS洗滌2次，再離心去PBS后加入1 mL碘化吡啶，避光30 min，200目濾網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測Bcl和Bax蛋白 選擇對數(shù)生長期胃癌SGC-7901細(xì)胞，常規(guī)消化后制成單細(xì)胞混懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度后以2×107/L接種于小培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛貼壁后，去掉原培養(yǎng)液。分4組:對照組、奧曲肽組、奧美拉唑組、奧曲肽+奧美拉唑組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次加入含藥血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化，計(jì)數(shù)，離心，PBS液洗滌2次。加入1∶100稀釋的一抗100 μL，37℃恒溫水浴溫育30 min，PBS液洗2次。加1∶20稀釋的 FITC標(biāo)記的二抗100 μL，37 ℃溫育30 min，PBS 液洗2 次，離心，除去未結(jié)合的多余熒光抗體。加PBS液1.0 mL，用400目濾網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀檢測，測試前用雞紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品調(diào)整儀器的變異系數(shù)值在5%以內(nèi)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，方差齊性檢驗(yàn)或正態(tài)檢驗(yàn)后進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 奧曲肽和奧美拉唑單用及合用對SGC-7901細(xì)胞生長的影響 隨著不同濃度的奧曲肽與奧美拉唑的濃度升高，藥物對SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，效應(yīng)逐漸增加，聯(lián)合用藥的抑制率較相應(yīng)單用藥組顯著增強(qiáng)，結(jié)果見表1。

表1 奧曲肽和奧美拉唑?qū)GC-7901細(xì)胞生長的影響(n=9)

2.2 奧曲肽與奧美拉唑聯(lián)合作用SGC-7901細(xì)胞的中效效應(yīng) 按中效方程式計(jì)算得單用奧曲肽的中效濃度為6.92 mg/L，單用奧美拉唑時(shí)中效濃度為85.52 mg/L，當(dāng)奧曲肽與奧美拉唑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，奧曲肽、奧美拉唑的中效濃度分別為1.01、49.42 mg/L。同時(shí)，奧曲肽和奧美拉唑在低效應(yīng)水平時(shí)CI＞1，而在多數(shù)效應(yīng)范圍尤其是高水平效應(yīng)時(shí)，CI指數(shù)均＜1，相互之間表現(xiàn)為協(xié)同作用，見圖1。

圖1 奧曲肽和奧美拉唑合用時(shí)CI與fa的關(guān)系圖

2.3 奧曲肽與奧美拉唑?qū)GC-7901細(xì)胞生長周期的影響 與對照組比較，1.0 mg/L奧曲肽能夠阻滯SGC-7901細(xì)胞的生長，使G0/G1期細(xì)胞增多(P＜0.05)，而50.0 mg/L奧美拉唑?qū)?xì)胞周期影響不大，但相同濃度的奧曲肽和奧美拉唑共同作用胃癌細(xì)胞SGC-7901后，G0/G1細(xì)胞比例顯著增大(P＜0.05)，而且超過單用藥組。

表2 奧曲肽與奧美拉唑單用及聯(lián)用對SGC-7901細(xì)胞周期的影響(%，n=3)

2.4 奧曲肽與奧美拉唑?qū)GC-7901細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，各組胃癌SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過藥物處理后，各給藥組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)均減少，Bax蛋白增加，見表3。

表3 奧曲肽和奧美拉唑?qū)GC-7901細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響(n=3)

3 討論

奧曲肽是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的生長抑素類似物，可治療消化道出血［8］、胰腺炎［9］、內(nèi)分泌腫瘤以及胃、腸、胰等實(shí)體腫瘤，通過直接和間接作用發(fā)揮抗腫瘤作用［10］。研究表明，奧曲肽對人體內(nèi)胃癌生長具有明顯抑制作用［11］。質(zhì)子泵抑制劑抗腫瘤的效應(yīng)機(jī)制可能是顯著降低了腫瘤細(xì)胞的異常高pH梯度，即胞外酸性pH和胞質(zhì)堿性pH，阻止V-ATPases反應(yīng)，進(jìn)而允許抗瘤藥物進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮功能。早期研究［12］顯示，PPI在體內(nèi)外抑制胃癌細(xì)胞凋亡。蔣鵬程等［13］報(bào)道，奧美拉唑可以誘導(dǎo)胃癌前病變組織細(xì)胞凋亡。張正等［14］報(bào)道，奧美拉唑能夠直接抑制胃癌細(xì)胞HGC-803的增殖。奧美拉唑作用胃癌細(xì)胞SGC-7901的相關(guān)報(bào)道較少。本研究中，奧美拉唑以濃度依賴方式明顯抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901生長。奧曲肽與奧美拉唑聯(lián)合應(yīng)用后，隨著濃度的增加，抗腫瘤作用也隨之增強(qiáng)，中效原理分析，兩者在大多數(shù)效應(yīng)尤其是高效應(yīng)范圍合用時(shí)，均產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)(CI＜1)，聯(lián)合用藥的中效濃度明顯低于單用藥時(shí)各自的中效濃度，表明奧曲肽和奧美拉唑聯(lián)合作用比單獨(dú)作用效果好，能夠增強(qiáng)對胃癌細(xì)胞SGC-7901生長抑制作用。通過對流式細(xì)胞周期分析，與對照組比較，聯(lián)合用藥和單用奧曲肽作用胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，G0/G1期細(xì)胞比例增多(P＜0.05)，奧美拉唑?qū)?xì)胞周期影響不大，并且聯(lián)合用藥組與單用藥組G0/G1期細(xì)胞比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示奧美拉唑可能增強(qiáng)奧曲肽對胃癌細(xì)胞周期的阻滯作用，也間接證明奧美拉唑和奧曲肽共同作用胃癌細(xì)胞具有協(xié)同效應(yīng)。同樣，聯(lián)合用藥能夠顯著下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，聯(lián)合用藥的效果優(yōu)于單用藥組(P＜0.05)，有協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，這種協(xié)同作用的機(jī)制尚不明確，可能是奧美拉唑改變了胃癌細(xì)胞的酸性環(huán)境而增強(qiáng)了奧曲肽的作用，值得深入研究。

［1］沈秋瑾，覃文新.靶向腫瘤酸性微環(huán)境的抗腫瘤策略［J］.生命科學(xué)，2008，20(5):795-710.

［2］陳瑞豐，杜國平.生長抑素與胃癌關(guān)系的研究現(xiàn)狀［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，7(6):178-179.

［3］Kumar M，Liu ZR，Thapa L，et al.Antiangiogenic effect of somatostatin receptor subtye 2 on pancreatic cancer cell line:inhibition of vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinase-2 expression in vitro［J］.Word J Gastroenterol，2004，10:393-399.

［4］Casini Raggi C，Calabro A，Renzid，et al.Quantitative evaluation of somatostain receptor subtype 2 expression in sporadic colorectal tumor and in the corresponding normal mucosa［J］.Clin Cancer Res，2002，8:419-427.

［5］De Milito A，F(xiàn)ais S.Proton pump inhibitors mayreduce tumour resistance［J］.Expert Opin Pharmacother，2005，6(7):1049-1054.

［6］陳淮軍.生長抑素治療非靜脈曲張性上消化道大出血療效觀察［J］.中國醫(yī)藥，2011，6(12):1504-1505.

［7］徐暉，莊麗維，劉娜，等.奧曲肽、生長抑素治療肝硬化上消化道出血療效觀察［J］.中國臨床醫(yī)學(xué)，2006，13(6):934-935.

［8］吳衛(wèi)東.奧曲肽治療非靜脈曲張性上消化道出血療效觀察［J］.中國醫(yī)藥，2009，4(10):758-759.

［9］陳霞，王素云，葉麗萍.奧曲肽預(yù)防內(nèi)鏡下逆行胰膽管造影術(shù)后高淀粉酶血癥和急性胰腺炎發(fā)生的作用［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(5):814-815.

［10］孫培龍，胡靜波.生長抑素及類似物治療腫瘤機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.世界腫瘤雜志，2006，5(3):157-159.

［11］田蕾，李舒.生長抑素類似物奧曲肽對人胃癌生長的抑制作用研究［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(5):1652-1655.

［12］Yeo M，Kim DK，Kim YB.Selective induction of apoptosis with proton pump inhibitor in gastric cancer cells［J］.Clin Cancer Res，2004，10(24):8687-8696.

［13］蔣鵬程，倪洪昌，李琦恒.奧美拉唑?qū)ξ赴┣安∽兗?xì)胞凋亡的影響［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26(4):405-408.

［14］張正，李紹敏，劉小菁.奧美拉唑抑制胃癌細(xì)胞株生長［J］.四川醫(yī)學(xué)，1999，20(2):122-123.