張凌云，歐 敏，顧 玨，宋秀杰

低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1-alpha，HIF-1α)是細(xì)胞為適應(yīng)缺氧環(huán)境所產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子。最新研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與低氧肺血管收縮和低氧肺動(dòng)脈高壓聯(lián)系緊密。HIF-1α蛋白的表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄活性主要受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)，缺氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)活性氧升高，并反饋性刺激HIF-1α的表達(dá)，可通過HIF-1α-瞬時(shí)受體鈣離子通道和活性氧(reactive oxygen species，ROS)-蛋白激酶C等多個(gè)信號途徑促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高和各種活性介質(zhì)的生成，進(jìn)而刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)的增殖和肺血管的收縮、重塑，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的不可逆性病理改變[1-2]。

目前，臨床上尚無有效治療肺動(dòng)脈高壓的方法。益肺活血顆粒是中醫(yī)內(nèi)科學(xué)家董建華院士在補(bǔ)中益氣湯與血府逐瘀湯基礎(chǔ)之上辨證加減而配制的一組中藥復(fù)方，多年來一直應(yīng)用于慢性阻塞性肺疾病及慢性肺心病的治療，臨床療效顯著。前期動(dòng)物研究也發(fā)現(xiàn)該藥具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制中膜增厚、減輕血管縮窄、降低肺動(dòng)脈高壓的功能[3-4]。本研究著重觀察該藥對低氧培養(yǎng)大鼠PASMCs內(nèi)HIF-1α和ROS的影響，從分子水平探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 益肺活血顆粒(yifeihuoxue granule，YFHXG)，原始的未經(jīng)加工干粉劑，鈷60滅菌，海軍總醫(yī)院藥劑科提供。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備 達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM/F12 培養(yǎng)基(GIBCO 公司，美國)，2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯 (2'，7'-dichlorfluorescein diacetate，DCFDA)探針(Molecular Probes公司，美國)，兔抗大鼠HIF-1α抗體(武漢博士德公司)，免疫組化試劑盒，3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)試劑盒(天津?yàn)笊锕?，噻唑藍(lán)[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]試劑盒(北京凱欣杰生物科技公司)，抗β-actin單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)。激光共聚焦顯微鏡(Beckman Coulter公司，美國)，缺氧CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)，酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備 20只SD大鼠雌雄各半，體質(zhì)量50～150 g(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所提供)，隨機(jī)分為4組:空白對照組和YFHXG高、中、低濃度組，每組5只。YFHXG各組每天2次分別以高濃度(16.5 g/kg)、中濃度(3.3 g/kg)、低濃度(0.66 g/kg)灌胃，空白組以同等量的生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d;末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12 h)給藥2 h后腹主動(dòng)脈采血，離心后分離血清，合并同組含藥血清，0.22 μm微孔濾膜過濾后，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大鼠PASMCs原代培養(yǎng)和鑒定 選用成年SD大鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量150～250 g。2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉后，無菌條件下取出心肺，輕柔分離肺動(dòng)脈，在外科手術(shù)顯微鏡下仔細(xì)剝除肺動(dòng)脈內(nèi)、外膜，用眼科剪將肺動(dòng)脈中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，3～5 d換1次培養(yǎng)液(含15%胎牛血清的DMEM/F12)。14 d后細(xì)胞爬出，呈典型峰、谷狀分布，抗β-actin單克隆抗體免疫組化染色鑒定為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，純度在98%以上。胰酶消化傳代培養(yǎng)，采用生長良好的3～5代PASMCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將生長良好的3～5代的PASMCc按實(shí)驗(yàn)分為5組:①常氧組(21%O2)，常氧條件下加入含10%空白藥物血清的DMEM/F12培養(yǎng)液;②缺氧組(3%O2)，缺氧條件下加入含10%空白藥物血清的DMEM/F12培養(yǎng)液;③缺氧+YFHXG高濃度組，缺氧條件下加入含10%高濃度(16.5 g/kg)藥物血清的DMEM/F12培養(yǎng)液;④缺氧+YFHXG中濃度組，缺氧條件下加入含10%中濃度(3.5 g/kg)藥物血清的DMEM/F12培養(yǎng)液;⑤缺氧+YFHXG低濃度組，缺氧條件下加入含10%低濃度(0.66 g/kg)藥物血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。

1.2.4 MTT法 將生長良好的3～5代PASMCs以每孔8×103/10 μl接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后換不含胎牛血清的DMEM/F12同步化培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件同上，按實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入MTT 10 μl，繼續(xù)孵育4 h后直接加入甲瓚溶解液每孔100 μl，置于CO2培養(yǎng)箱再孵育4 h，用酶標(biāo)儀于570 nm 處測定吸光度值(A570nm=A實(shí)驗(yàn)組－A空白組)，每組8個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS濃度測定 將生長良好的3～5代PASMCs接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長密度達(dá)70%時(shí)，按不同實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCF-DA，充分覆蓋細(xì)胞，避光置37℃孵育20 min后棄去染液，用無血清培養(yǎng)液DMEM/F12沖洗細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入胞內(nèi)的DCF-DA，再加入1 ml平衡液用于檢測。將染色好的細(xì)胞置于倒置激光共聚焦顯微鏡下，設(shè)定好參數(shù)(激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為550 nm)，每組隨機(jī)選取6個(gè)，每個(gè)樣本選擇3個(gè)視野進(jìn)行攝像分析。結(jié)果利用控制軟件image-pro plus 5.0進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測定，取DCF-DA的平均熒光強(qiáng)度反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.2.6 免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶連接(streptomycin avidin-biotin-peroxidase connection，SP)法測定 HIF-1α蛋白含量 將生長良好的PASMCs懸液置于帶有小蓋玻片的6孔板中制作細(xì)胞爬片，按不同實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)24 h后，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗3遍，加4%多聚甲醛固定10 min，PBS再?zèng)_洗3遍，依照SP試劑盒步驟進(jìn)行。每組隨機(jī)選6張爬片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每張爬片用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析，測量陽性細(xì)胞的平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PASMCs吸光度值變化 各組PASMCs分別培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，與常氧組相比，缺氧組吸光度值顯著升高(P＜0.05)，PASMCs增殖明顯，數(shù)目增多，且細(xì)胞向合成型轉(zhuǎn)化。與缺氧組相比，缺氧+YFHXG高、中濃度組吸光度值顯著降低，生長受抑制，數(shù)目減少，舒張明顯，并且具有劑量依賴性(P＜0.05);而缺氧+YFHXG低濃度組對PASMCs的增殖無顯著抑制作用(P＞0.05)。

表1 PASMCs吸光度值變化(n=8)

2.2 PASMCs內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá) 與常氧組相比，缺氧組PASMCs內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)顯著升高;與缺氧組相比，缺氧+YFHXG高、中濃度組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白顯著降低，且具有劑量依賴性(圖1)。

圖1 PASMCs內(nèi)HIF－1α蛋白表達(dá)

2.3 PASMCs內(nèi)ROS含量 缺氧組細(xì)胞內(nèi)ROS顯著升高，與常氧組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。缺氧+YFHXG組細(xì)胞內(nèi)ROS顯著降低，且具有劑量依賴性;缺氧+YFHXG低濃度組與缺氧組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其他各組與缺氧組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見圖2。

圖2 PASMCs內(nèi)ROS含量

3 討論

HIF-1是一個(gè)由調(diào)節(jié)性HIF-α及構(gòu)成性表達(dá)HIF-1β兩個(gè)亞基組成的異源二聚體。HIF-1α是HIF-1的調(diào)節(jié)亞基和活性亞基，常氧條件會(huì)通過氧依賴降解結(jié)構(gòu)域被降解，低氧時(shí)HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β形成二聚體后激活靶基因的轉(zhuǎn)錄;是細(xì)胞為適應(yīng)缺氧環(huán)境和各種病理刺激所表達(dá)的核心調(diào)控因子，可調(diào)控多種與低氧條件下細(xì)胞生存相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，這其中就包括編碼內(nèi)皮素-1、血紅素加氧酶-1/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、瞬時(shí)感受器電位等多種血管活性物質(zhì)的基因，與低氧性肺動(dòng)脈高壓和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖關(guān)系密切[5-6]。

ROS主要由細(xì)胞內(nèi)線粒體和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶介導(dǎo)而生成，與機(jī)體炎癥和細(xì)胞內(nèi)氧含量關(guān)系密切。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，低氧可通過催化PASMCs內(nèi)NADPH氧化酶而產(chǎn)生ROS，ROS則可作為第二信使直接參與細(xì)胞分化、增殖及凋亡的調(diào)節(jié)，其可能是通過相關(guān)激酶的表達(dá)來調(diào)節(jié)HIF-1α的含量和活性[7-8]。另外，細(xì)胞在長期進(jìn)化過程中形成了由抗氧化酶和ROS生成酶所形成的氧化還原平衡，該平衡對HIF-1通路的活性調(diào)節(jié)起著重要的作用[9]。而最新研究發(fā)現(xiàn)，ROS在缺氧性肺血管重建的發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮重要作用，它參與肺動(dòng)脈平滑肌的收縮、增殖及凋亡等活性的調(diào)控。但是有關(guān)缺氧時(shí)ROS生成量的變化及其對PASMCs收縮和凋亡影響的研究結(jié)果尚存爭議[10-11]。

益肺活血顆粒是我國著名中醫(yī)內(nèi)科學(xué)家董建華院士多年來治療慢性阻塞性肺疾病和慢性肺心病的代表方，在補(bǔ)中益氣湯與血府逐瘀湯基礎(chǔ)之上辨證加減而制成，其臨床療效顯著，而且前期動(dòng)物研究和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)該藥具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、減輕血管縮窄、降低肺動(dòng)脈高壓的功能。在此基礎(chǔ)上，我們猜測其可能有對抗缺氧和通過某種途徑改善細(xì)胞的缺氧反應(yīng)，而HIF-1α和ROS是細(xì)胞缺氧時(shí)重要的活性介質(zhì)。

本研究通過分離培養(yǎng)大鼠PASMCs，并同時(shí)給予低氧和不同濃度的益肺活血顆粒含藥血清進(jìn)行干預(yù)，觀察發(fā)現(xiàn)缺氧條件下PASMCs向合成型轉(zhuǎn)化:增生肥大、胞內(nèi)線粒體增多、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)大、高爾基復(fù)合物高度合成[12];而相比缺氧組，培養(yǎng)3 d后顯微鏡下可直接觀察到缺氧+YFHXG高、中濃度組的PASMCs生長受抑制，數(shù)目減少，且舒張明顯，可能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度下降相關(guān)。通過免疫組化法測定細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡測定細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，發(fā)現(xiàn)與常氧組相比，缺氧組PASMCs增殖明顯活躍，HIF-1α蛋白表達(dá)及ROS含量增加;與缺氧組相比，缺氧+YFHXG高、中濃度組大鼠PASMCs的生長明顯受抑制，而且HIF-1α蛋白表達(dá)及ROS含量降低。

本研究結(jié)果說明了缺氧可以直接刺激PASMCs的增殖;而益肺活血顆?？梢燥@著抑制低氧對大鼠PASMCs的促增殖作用，其機(jī)制可能是通過抑制HIF-1α-ROS信號通路來實(shí)現(xiàn)，從而在改善肺血管重構(gòu)、降低肺動(dòng)脈高壓方面有著獨(dú)特的療效，有望成為祖國醫(yī)藥中治療肺動(dòng)脈高壓的良藥，但其抑制PASMCs增殖的機(jī)制還須進(jìn)一步深入探討。

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