王欲曉，解 鵬，高榮凱，楊東玲，周麗君

生存素(survivin)是由 Ambrosini等[1]在 1997年發(fā)現(xiàn)的，是凋亡抑制蛋白家族成員，由142個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為16.5×103的蛋白。研究發(fā)現(xiàn):survivin主要分布于胚胎及分化未成熟的組織，在成人體內(nèi)僅在胸腺、甲狀腺、子宮內(nèi)膜組織、生殖腺中有微量表達(dá)，在其他正常組織中均未檢測到其表達(dá)，而在大部分腫瘤中則高表達(dá)尤其是肺、乳腺、腦、腸等組織中。Survivin在進化上高度保守，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和抑制凋亡的功能，是目前已知作用最強的凋亡抑制蛋白之一。Survivin對細(xì)胞凋亡的抑制及其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的特異性，使得以survivin為靶點治療惡性腫瘤的設(shè)想成為近年來研究的新熱點[2-3]。

國外已開展針對該蛋白的抑制劑、反義寡核苷酸、小分子干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)的研究，以期篩選到具有應(yīng)用前景的治療藥物。目前，已經(jīng)有多種針對survivin靶點的藥物開始進行Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗，如反義寡核苷酸LY21830B、轉(zhuǎn)錄抑制劑YM155等，并顯示出良好治療效果[4]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，治療性單抗已成為發(fā)展最快的生物藥物，是生物制藥的熱點，特別是針對惡性腫瘤的治療性抗體是開發(fā)最活躍的領(lǐng)域。如用于治療乳腺癌的曲妥珠單抗、治療B淋巴細(xì)胞瘤的利妥昔單抗等在臨床應(yīng)用中均顯示了良好的效果[5]。但針對細(xì)胞內(nèi)survivin蛋白的治療性人源抗體研究鮮見報道。我們實驗室在軍隊“十五”重點課題的資助下，構(gòu)建了經(jīng)重組酶系統(tǒng)cre-loxp定位介導(dǎo)的大容量天然抗體庫，并從中篩選到針對不同抗原的多株人源抗體[6-7]。本研究嘗試從該抗體庫中篩選出人源抗survivin抗體，探討其在今后腫瘤治療中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 大容量抗體庫及主要試劑 大容量噬菌體抗體庫為本中心構(gòu)建，survivin由海軍總醫(yī)院檢驗科郭建巍博士贈送[8]，輔助病毒VCSM13、大腸桿菌菌株XL1-Blue為本中心保存，各種內(nèi)切酶均為promega公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶-V5(horseradish perroxidase，HRP-V5)、卵清蛋白(ovalbumin，OA)和鐵蛋白(ferritin，F(xiàn)er)購自美國SIGMA 公司，HRP-抗M13購自美國通用電氣公司，survivin兔多抗購自中杉金橋公司、HRP-羊抗兔IgG購自英國Abcam公司，抗原管(immuno-tube)購自丹麥NUNC公司。

1.2 大容量噬菌體抗體庫的優(yōu)化與制備 初級噬菌體抗體庫以100∶1的比例復(fù)合感染(multiplicity of infection，MOI)BS1365細(xì)胞，37℃水浴保溫1 h，使多副本載體進入同一個細(xì)胞，加含氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的2YT 培養(yǎng)液至 400 ml，Amp 終濃度為100 μg/ml。振蕩培養(yǎng)至吸光度A600=0.5左右加5 ml輔助病毒VCSM13(滴度1.7×1012cfu/ml)，30℃培養(yǎng)過夜，離心回收上清，聚乙二醇8000(polyethylene glycol 8000，PEG8000)沉淀回收，測定滴度。再以MOI≤1的比例感染1 000 ml對數(shù)生長期的 XL1-Blue菌，37℃靜止30 min;取少量鋪含Amp的培養(yǎng)盤計算庫容，補足 Amp，加入8 ml VCSM13，30℃過夜，次日回收上清，常規(guī) PEG8000沉淀。1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶解[9-10]。

1.3 抗survivin噬菌體抗體的篩選 將survivin抗原用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液Buffer稀釋至50 μg/ml，以1 ml包被免疫管，4℃過夜，次日用3%脫脂奶封閉2 h，加入1 ml噬菌體抗體庫(約1×1013cfu/ml)，37℃孵育2 h，以含0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸酯(Tween)-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗15次(第1輪洗15次，第2～4輪洗滌20次以上)，加入1 ml新鮮XL1-Blue菌直接感染，37℃孵育15 min，在孵育過程中輕輕的搖動幾次，使其更好地與抗體結(jié)合，提高感染的效果，轉(zhuǎn)入10 ml超級營養(yǎng)肉湯(super broth，SB)培養(yǎng)液中;從回收的菌液取適量鋪在含有Amp培養(yǎng)盤測定滴度，其余菌液37℃培養(yǎng)1 h，加入含有Amp培養(yǎng)液增至為100 ml，2～3 h后，長到對數(shù)生長期加入1 ml滴度為2.3×1012cfu/ml輔助病毒VCSM13，30℃振蕩培養(yǎng)過夜。每輪篩選后均測定次級庫的滴度，并計算噬菌體抗體的回收率[11-12]。

1.4 噬菌體抗體的制備 從篩選第3、第4輪的培養(yǎng)盤隨機挑取集落在含有Amp的2YT培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，第2天取30 μl細(xì)菌到1 ml SB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入輔助病毒VCSM13，30℃培養(yǎng)過夜，離心收取上清即得到噬菌體抗體。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法鑒定噬菌體抗體 將survivin稀釋至 2 μg/ml，以每孔 50 μl包被 ELISA 板，4℃過夜，棄去孔內(nèi)液體，用3%脫脂奶-PBS封閉2 h后加入待檢測的噬菌體抗體液，37℃孵育2 h，用0.05%Tween-20 PBS注滿洗滌3次，加入二抗HRP-抗M13鼠單抗，孵育1 h，洗滌后加入鄰苯二胺鹽酸鹽(O-phenylendiamine dihydrochloride，OPD)底物顯色，讀取吸光度A490值。顯色陽性的克隆再以survivin、OA、Fer為抗原同時包被ELISA板，鑒定其抗原抗體反應(yīng)的特異性。

1.6 可溶性抗體的的表達(dá)及檢測 用陽性噬菌體抗體感染HB2151菌株后鋪含Amp培養(yǎng)盤，第2天挑克隆，細(xì)菌在對數(shù)生長期加入異丙基-β-D-硫化半乳糖苷(1 mmol/L)28℃誘導(dǎo)，得到可溶性的抗體。ELISA方法同上，加入待檢測的可溶性上清，以HRP-V5為二抗;陽性對照孔加入1∶500稀釋的抗survivin兔多抗，二抗為1∶1 000稀釋的HRP-羊抗兔IgG，分別檢測上清中單鏈的表達(dá)與生長素的結(jié)合活性及其特異性。

2 結(jié)果

2.1 工作庫制備結(jié)果 原始噬菌體抗體庫通過重組酶系統(tǒng)cre-loxp介導(dǎo)的定位重組，擴增出一個新的大容量噬菌體庫，獲得庫容為4×1010的大容量人源噬菌體抗體庫，所獲抗體庫滴度為3×1012cfu/ml。

2.2 抗survivin噬菌體抗體的篩選結(jié)果 經(jīng)過4輪的篩選，測定每輪洗脫回收的噬菌體滴度，發(fā)現(xiàn)有一定的富集(表1)。

表1 噬菌體抗體庫的投入產(chǎn)出比

2.3 抗survivin噬菌體抗體結(jié)合活性 從第3、第4輪菌落中隨機挑取100個克隆，制備噬菌體抗體。ELISA表明，21個能與 survivin抗原結(jié)合，隨后用OA、Fer作為對照鑒定，特異性結(jié)合的克隆為10個。表2為從中選取的4個結(jié)合活性較高的陽性克隆、1個陰性克隆與各抗原反應(yīng)結(jié)果。

表2 噬菌體抗體與不同抗原反應(yīng)的ELISA檢測

2.4 可變區(qū)基因的多樣性分析(DNA指紋) 將篩選到的10個噬菌體陽性克隆進行可變區(qū)基因擴增，酶切消化得到DNA指紋圖譜，10個陽性菌落系來自8種不同的scFv基因克隆，其中2、6、9為相同指紋(圖1)。

圖1 陽性克隆可變區(qū)基因的指紋圖譜

2.5 可溶性scFv抗體的表達(dá) 將篩選出的特異性8種噬菌體克隆，制備可溶性抗體，用OA、Fer進行特異性鑒定，其中5個克隆經(jīng)ELISA檢測具有較高的特異結(jié)合活性。

表3 可溶性抗體與不同抗原反應(yīng)的ELISA檢測

3 討論

噬菌體抗體庫技術(shù)出現(xiàn)于20世紀(jì)90年代初期，是將全套人的抗體基因克隆到噬菌體載體中，利用其呈現(xiàn)在噬菌體表面的特點，經(jīng)過幾輪“吸附—洗脫—擴增”的淘篩，除可以方便地用不同抗原篩選出相應(yīng)的人源抗體外，還可以同時獲得針對同一抗原的不同基因型的多株抗體，顯示了其良好的應(yīng)用前景[13-14]。

細(xì)胞內(nèi)抗體可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或直接進入細(xì)胞，與特定的靶分子作用(干擾或阻斷靶分子的加工、分泌或功能)從而發(fā)揮其生物學(xué)功能的抗體[15]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多具有重要作用的細(xì)胞內(nèi)功能蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞內(nèi)抗體一方面可作為一種外源性重組抗體，特異性地作用于細(xì)胞內(nèi)抗原，作為表型基因敲除的研究工具;另一方面，如果將抗體的結(jié)構(gòu)域與適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘柸诤辖M裝，即可將其定位在細(xì)胞內(nèi)靶抗原的相應(yīng)位置，達(dá)到抑制靶蛋白功能。腫瘤基因治療也是細(xì)胞內(nèi)抗體技術(shù)應(yīng)用的一個重要領(lǐng)域，這方面的研究主要集中在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的某些蛋白及與腫瘤細(xì)胞耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白上。如酪氨酸激酶家族成員erbB-2在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化中起重要作用，抗erbB-2細(xì)胞內(nèi)抗體用于卵巢癌患者治療已進入Ⅰ期臨床。又如Cyclin E是調(diào)節(jié)正常細(xì)胞分裂的一種重要的細(xì)胞周期蛋白，在乳腺癌中高表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗Cyclin E抗體可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長[16-17]。

單鏈抗體是由可變區(qū)域重鏈VH和可變區(qū)域輕鏈VL中間加一段linker構(gòu)成，與完整抗體及抗體的Fab段相比具有相對分子質(zhì)量小、免疫原性低、穿透力強等優(yōu)點，一般用其作為細(xì)胞內(nèi)抗體[18]，有利于作為“導(dǎo)向載體”等應(yīng)用于人體。本研究中，我們利用人源大容量噬菌體抗體庫篩選到多株針對survivin特異性結(jié)合的人源抗體。由于survivin蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)，下一步我們將對獲得抗體進行生物功能的測定，以期獲得具有臨床應(yīng)用前景的人源抗survivin抗體。

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