彭 力，鐘禮立，黃 寒，厲 娟，梁 沫，李 云

（湖南省人民醫(yī)院兒科，長沙410005）

嬰幼兒喘息是小兒呼吸道疾病的一種常見癥狀，有反復發(fā)作傾向，其中30%～50%患兒可發(fā)展成哮喘。而判斷哪些嬰幼兒喘息最終會發(fā)展為哮喘，需要早期干預治療仍然是目前喘息性疾病防治的一個難點。CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg），具有低反應性和免疫抑制兩大功能特性，但具有免疫調(diào)節(jié)或抑制活性的細胞主要是高表達CD25＋的CD4＋T細胞（CD4＋CD25higTreg）。人轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是Treg分化發(fā)育的關(guān)鍵基因，主要表達于CD4＋CD25higTreg。Treg在兒童支氣管哮喘和過敏性疾病的發(fā)病中表達是下調(diào)的，但在嬰幼兒喘息中的表達研究甚少。本研究試圖通過對首次喘息嬰幼兒CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及叉頭／翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）mRNA表達的研究，探討有特應征和非特應征喘息嬰幼兒CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及Foxp3mRNA表達變化及與IgE的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2010年10月至2011年1月因喘息性疾病住院的嬰幼兒（首次發(fā)作）55例，兩肺聽診有喘鳴音，其中4例（后來經(jīng)胸部CT、纖維支氣管鏡檢查有支氣管軟化2例、呼吸道異物2例）除外，共51例患兒，其中男36例，女15例；年齡1個月至3歲（中位年齡8個月）。其中特應征組28例，男22例，女6例；有濕疹、過敏性鼻炎等特應征及特應征家族史。非特應征喘息組23例，男14例，女9例；無濕疹、過敏性鼻炎等特應征及特應征家族史。對照組20例，為門診健康體檢者，無家族過敏史及近期無呼吸道感染嬰幼兒。采血前2周均未用過糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥及免疫調(diào)節(jié)劑。

1.2 方法

1.2.1 CD4＋CD25＋Treg和CD4＋CD25higTreg測定 CD4＋CD25＋Treg和CD4＋CD25higTreg的測定分別采集喘息嬰幼兒及健康患兒外周靜脈血2mL，肝素抗凝；取肝素抗凝的全血100μL，加入CD4－PE和 CD25－FITC單克隆抗體20μL，IgG1－PE和IgG1－FITC作為同型對照，室溫閉光反應30min；加2mL溶血劑在室溫下溶解紅細胞約10min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，離心 5min（1 500r／min），棄上清；每份標本加入1%多聚甲醛500μL后用流式細胞儀檢測。流式細胞儀為Beckman－CoulterXL100（Coulter公司產(chǎn)品）。

1.2.2 RT－PCR檢測 PBMCsFoxp3mRNA 的表達 分離外周血中單個核淋巴細胞，用PBS洗滌2次，加入Trizol提取細胞總RNA，經(jīng)紫外線分光光度法定量后，取5μgRNA在寡聚脫氧胸苷酸（oligo－dT）和Moloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）存在的情況下進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成互補DNA（cDNA），以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列為：Foxp3（176bp）正義5′－CAG CAC ATT CCC AGA GTT CCT C－3′，反義5′－GCG TGT GAA CCA GTG GTA GAT C－3′，內(nèi)參基因三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（598bp）正義5′－CCA CCC ATG GCA AAT I′CC ATG GCA－3′，反義5′－TCT AGA CGG CAG GTC AGG TCC ACC－3′。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，60℃退火2min，72℃延伸2min，32個循環(huán)后PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳。電泳圖像用英國UVP公司GDS8000型全自動圖像分析系統(tǒng)處理，以同一標本的Foxp3與內(nèi)參照GAPDH擴增條帶的光密度比值。

1.2.3 血清總IgE水平測定 取另外2mL外周血，取血清用瑞典瑪西亞公司UniCAP變應原檢測系統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清總IgE水平。

2 結(jié) 果

2.1 喘息組和對照組 CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA比較 喘息患者外周血CD4＋CD25＋Treg和CD4＋CD25higTreg細胞占CD4＋T細胞的百分比及Foxp3mRNA均明顯低于健康對照組。性別、年齡與CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及Foxp3mRNA表達不相關(guān)。見表1和圖1。

表1 喘息組和對照組CD4＋CD25＋、CD4＋CD25hig Treg百分率及Foxp3mRNA比較（±s）

表1 喘息組和對照組CD4＋CD25＋、CD4＋CD25hig Treg百分率及Foxp3mRNA比較（±s）

＊：P＜0.01，與對照組比較。

組別 nCD4＋CD25＋Treg（%）CD4＋CD25higTreg（%）Foxp3m RNA／GAPDH喘息組 51 6.31＋2.96＊ 3.52＋1.46＊ 0.27＋0.11＊對照組20 9.28＋2.40 4.81＋1.50 0.39＋0.19

表2 兩組CD4＋CD25＋、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA與總IgE比較（±s）

表2 兩組CD4＋CD25＋、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA與總IgE比較（±s）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與非特應征喘息組比較。

組別 n CD4＋CD25＋Treg（%） CD4＋CD25higTreg（%） Foxp3mRNA／GAPDH 總IgE特應征喘息組 28 4.66＋1.17＊ 2.50＋0.52＊ 0.24＋0.13＊ 102.00＋47.43＊＊非特應征喘息組 23 7.96＋3.33 4.56＋2.01 0.30＋0.08 26.85＋15.30

圖1 喘息嬰幼兒外周血Treg Foxp3mRNA和參比基因電泳圖

2.2 特應征喘息與非特應征喘息嬰幼兒CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA、IgE比較 特應征喘息組外周血CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg比率及Foxp3mRNA均明顯低于非特應征喘息組，而總IgE較非特應征喘息組高，且各組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2和圖2、3。

2.3 CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及 Foxp3 mRNA與總IgE相關(guān)分析 CD4＋CD25higTreg及Foxp3mR－NA與總IgE相關(guān)分析呈負相關(guān)（r＝－0.75，r＝－0.61，P＜0.01）；而該組CD4＋CD25＋Treg與總IgE相關(guān)分析呈正相關(guān)（r＝0.36，P＜0.05）。

圖2 特應征喘息組和非特應征喘息組CD4＋CD25＋Treg占CD4＋T細胞的比率與對照組比較

圖3 特應征喘息組和非特應征喘息組CD4＋CD25higTreg占CD4＋T細胞的比率與對照組比較

3 討 論

Sakaguchi［1］于1995年首先描述 CD4＋CD25＋Treg是一個有免疫抑制特性的T細胞群，在應答單克隆抗－CD3或抗原刺激不會增殖，且能夠抑制CD4＋CD25－T細胞的增殖應答，占未免疫的小鼠和健康人外周CD4＋T細胞總數(shù)的5%～10%。根據(jù)CD4＋T細胞表達CD25的程度不同，CD4＋CD25＋Treg又可分為CD4＋CD25higTreg和CD4＋CD25lowTreg，在小鼠中，兩類細胞都有免疫活性，而有人認為在外周血中起免疫活性的是前者［2］。Foxp3是鑒別Treg的一個特異性標志物［3－4］，也是CD4＋CD25＋Treg發(fā)展和功能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Foxp3基因缺失使CD4＋CD25＋Treg抑制活性消失，而Foxp3在CD25－Treg異位表達則可恢復抑制活性［3－5］。目前研究表明，F(xiàn)oxp3主要表達于CD4＋CD25higTreg，達97%左右［6］。人Foxp3基因突變表現(xiàn)為IPEX（免疫失調(diào)、多內(nèi)分泌腺病、腸病、X連鎖綜合征），包括上升的IgE應答和變應性皮炎［7－8］。

目前研究顯示支氣管哮喘是Th2介導的以氣道高反應、可逆的氣流受阻、氣道嗜酸粒細胞侵潤、氣道黏液高分泌及血清高IgE為特征的氣道慢性炎癥性疾病。目前一般認為，哮喘患者體內(nèi)存在有Th1／Th2平衡改變，Th1細胞受到抑制，而Th2細胞異?；罨?，通過分泌IL－4、IL－5、IL－13等細胞因子促進B細胞合成IgE分子，刺激內(nèi)皮細胞表達更多黏附分子，使炎性細胞向病變局部浸潤。隨研究深入，Treg可能在支氣管哮喘和其他過敏性疾病中也起重要作用。長期暴露在哮喘發(fā)生時CD4＋Treg向Th2細胞偏移是因為Treg未形成，減少Treg數(shù)量或削弱Treg功能都可能導致哮喘的發(fā)生［9］。Hartl等［10］則認為，哮喘兒童肺泡灌洗液中CD4＋CD25higTreg值是下降的，其吸入糖皮質(zhì)激素與外周血和肺泡灌洗液CD4＋CD25higT細胞比例上升相關(guān)。同樣有研究表明，與對照組相比，哮喘兒童 CD4＋CD25＋Treg細胞、IL－10分泌型 CD4＋CD25＋Treg及 TGF－β分泌型CD4＋CD25＋Treg、Foxp3mRNA的數(shù)目是下降的，CD4＋CD25＋Treg下降可能與哮喘發(fā)病機制相關(guān)［11］。

嬰幼兒喘息多有反復發(fā)作的可能，它的發(fā)病機制目前仍不十分清楚，與特應性體質(zhì)、環(huán)境因素等有關(guān)，與哮喘可能存在相似的免疫學發(fā)病機制［12］。嬰幼兒哮喘早期即存在氣道炎癥反應和氣道重塑，而早期干預可防止肺功能長期、不可逆的損害。如何在喘息發(fā)作初期發(fā)現(xiàn)潛在的哮喘患兒成為當今研究的關(guān)鍵。本實驗結(jié)果顯示，喘息嬰幼兒CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及外周血Foxp3的表達明顯低于對照組，Treg及Foxp3可能在嬰幼兒喘息的疾病活動中起重要作用，可能參與嬰幼兒喘息的發(fā)病機制。

特應征是由IgE介導的，以Th2占優(yōu)勢的免疫應答所表達。特應征個體針對致敏原的Th2應答而非特應征個體不會，目前一個可能的解釋是Treg的影響，其有助于提高對變應原和其他炎癥刺激的免疫耐受［13］。本研究顯示，喘息特應征組CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg比非特應征組顯著降低，與朱亞飛等［14］研究報道呼吸道合胞病毒感染毛細支氣管炎特應征喘息組CD4＋CD25＋Treg比非特應征組降低一致，表明變應原特異的Treg在嬰幼兒變應性喘息個體是有缺陷的。另外，本實驗發(fā)現(xiàn)喘息特應征組CD4＋CD25higTreg與總IgE呈負相關(guān)，為此他推測CD4＋CD25higTreg參與嬰幼兒變應性喘息的發(fā)生發(fā)展過程，外周血下降的CD4＋CD25higTreg數(shù)目導致免疫抑制功能下降，從而導致Th2細胞大量增殖活化，IgE抗體分泌增加，產(chǎn)生大量致炎因子從而引起喘息發(fā)作，外周血CD4＋CD25higTreg比例可能是一個較好反映細胞免疫功能的參考指標，有可能對首次喘息嬰幼兒預后的早期預測有重要價值，今后有必要增加病例數(shù)及進行進一步隨訪和相關(guān)研究。而有趣的是，作者同時發(fā)現(xiàn)特應征喘息組CD4＋CD25＋Treg與總IgE呈正相關(guān)，這表明CD4＋CD25＋Treg有可能與特應征狀態(tài)相關(guān)，在變應原暴露和隨后的Treg激活下表達增加。已有報道在特應性皮炎個體，具有正常的抑制活性的CD4＋CD25＋Treg有正常的或相對高的數(shù)值［15－16］；哮喘個體，在急性加重期CD4＋CD25＋Treg是顯著增加的［17－18］。作者這部分研究與該兩篇報道存在相似性。Lee等［19］認為，來自相對嚴重特應征表型的個體，其CD4＋CD25＋Treg升高有可能代表在過敏性疾病加重時，作為一種免疫應答產(chǎn)生的誘導的或適應性T調(diào)節(jié)細胞。作者的進一步研究將對這些Treg進行更深入的認識，識別哪些部分Treg是真正的效應性T調(diào)節(jié)細胞。此外，本實驗與朱亞飛等［14］報道呼吸道合胞病毒感染毛細支氣管炎CD4＋CD25＋Treg與總IgE呈負相關(guān)不一致，可能原因為本實驗為首次喘息患兒，發(fā)病機制與呼吸道合胞病毒這種單一特殊病毒感染并非完全一致。同樣作者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3的表達也與IgE呈負相關(guān)，因此推測在嬰幼兒喘息的發(fā)病中可能存在Foxp3基因表達降低而導致Treg主要是CD4＋CD25higTreg下降而不能發(fā)揮正常的免疫抑制功能，而誘導Foxp3基因表達增加，進而誘導Treg增加是治療嬰幼兒喘息的重要機制之一。

綜上所述，喘息嬰幼兒有下降的CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及Foxp3表達，特應征組更為顯著，表明下降的Treg有可能代表喘息嬰幼兒尤其是特應征喘息兒的一種缺陷。

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