張貴勝，李 莉，常建軍，魏 青，張勤文

（1.青海省大通種牛場(chǎng)，青海大通810102；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016）

大通牦牛是在青藏高原自然生態(tài)條件下，通過(guò)引入野牦牛血液培育的牦牛新品種，在同等飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，改良后代牦犢牛生長(zhǎng)發(fā)育快，具有明顯的個(gè)體優(yōu)勢(shì)，因其育成于青海省大通種牛場(chǎng)而得名。線粒體是真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種重要而獨(dú)特的細(xì)胞器，是氧化磷酸化和形成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要場(chǎng)所，動(dòng)物體新陳代謝所需的能量主要由細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷直接提供，三磷酸腺苷水解釋放的能量是生物體維持細(xì)胞分裂、肌肉收縮、腺體分泌、神經(jīng)傳導(dǎo)等生命活動(dòng)所需能量的直接來(lái)源，所以ATP可以反映生物體新陳代謝的狀況。有關(guān)牦牛低氧適應(yīng)的相關(guān)機(jī)制已有一些報(bào)道，但牦牛肌組織線粒體生物學(xué)特性與低氧適應(yīng)性的關(guān)系報(bào)道甚少。本試驗(yàn)以同一海拔地區(qū)四個(gè)年齡段大通牦牛作為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定牦牛骨骼肌、心肌線粒體中Na＋－K＋－ATP、Ca2＋－Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP 和 Mg2＋－ATP 4種酶的活性，從發(fā)育學(xué)角度為研究大通牦牛高原低氧適應(yīng)性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 青海省大通種牛場(chǎng)（海拔3 300 m左右）牦牛，按照出生年齡分為1、30、180日齡和成年組，共4組，每組各5頭。

1.1.2 儀器及試劑 UV－1601紫外線分光光度計(jì)（SHIMADZU公司）；電子天平（瑞士產(chǎn) AB204－E）；普通離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠LD4－2）；低溫高速離心機(jī)（上海安亭）；超聲波；恒溫水浴鍋（KS648）。ATP酶；考馬斯亮藍(lán)測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理

1.2.1.1 組織的采集與處理 將牦牛屠宰后迅速取其心肌和骨骼肌組織，超低溫保存，制備組織勻漿，提取線粒體，用于牦牛線粒體ATP酶活性的測(cè)定。

1.2.1.2 組織勻漿的制備和線粒體的提取 取出樣本自然解凍后，在4℃的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱(chēng)取1.0 g于研缽中，加入4℃生理鹽水9 mL，用眼科小剪盡快剪碎組織，制備成100 g／L的組織勻漿，取100 g／L的組織勻漿用普通離心機(jī)以1 000 r／min～2 000 r／min，離心10 min，棄沉淀，取上清液以8 000 r／min～10 000 r／min（低溫高速離心機(jī)離心）15 min，沉淀物為線粒體（線粒體的提取由南京建成生物工程研究所提供，中性紅－詹納斯綠B染色鑒定線粒體），將分離的線粒體用冰冷的勻漿介質(zhì)制備成混懸液，用超聲波細(xì)胞破碎儀將其破碎，供線粒體中ATP酶活性的測(cè)定。

1.2.2 測(cè)定方法

1.2.2.1 總蛋白的測(cè)定 按南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮蘭蛋白試劑盒測(cè)定心肌、骨骼肌線粒體提取液中蛋白質(zhì)的含量，線粒體蛋白質(zhì)的含量用于計(jì)算線粒體4種ATP酶的活性。

1.2.2.2 ATP酶的測(cè)定 按南京建成生物工程研究所提供的ATP酶試劑盒操作步驟測(cè)定心肌、骨骼肌線粒 體 提 取 液 中 Na＋－K＋－ATP、Ca2＋－Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP 和 Mg2＋－ATP 4種酶的活力，以每小時(shí)每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為1個(gè)ATP酶活力單位來(lái)計(jì)算，即為μmolPi／mgprot／h。

三磷酸腺苷酶計(jì)算公式：

“＊”表示反應(yīng)時(shí)間10 min，乘以6為1 h，“＊＊”表示蛋白單位mg／mL。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)采用SAS（6.12版）軟件GLM過(guò)程進(jìn)行方差分析及Duncan’s進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)誤差為5%。

2 結(jié)果

不同發(fā)育期大通牦牛心肌線粒體ATP酶活性參數(shù)值見(jiàn)表1，心肌線粒體 Na＋－K＋－ATP、Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP和Ca2＋－Mg2＋－ATP 4種酶活性在年齡組間差異均不顯著（P＞0.05）。

不同發(fā)育期大通牦牛骨骼肌線粒體ATP酶活性參數(shù)值見(jiàn)表2。骨骼肌線粒體 Na＋－K＋ATP、Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP和 Ca2＋－Mg2＋ATP 4種酶活性在年齡組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 不同發(fā)育期大通牦牛心肌線粒體ATP酶活性參數(shù)值（ˉx±SD）Table1 The determination of cardiac mitochondrial atpase activity in various ages of yaks（ˉx±SD） μmol／mg

表2 不同發(fā)育期大通牦牛骨骼肌線粒體ATP活性參數(shù)值（ˉx±SD）Table2 The determination of skeletal muscle mitochondrial atpase activity in various ages of yaks（ˉx±SD） μmol／mg

3 討論

3.1 牦牛肌線粒體ATP酶活性與相關(guān)離子代謝平衡的關(guān)系

線粒體 ATP酶主要包括 Na＋－K＋－ATP、Ca2＋－Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP 和 Mg2＋－ATP 4 種 酶。Na＋－K＋－ATP酶和 Ca2＋－ATP酶對(duì)動(dòng)物滲透壓的調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)外離子平衡、膜興奮傳導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸及能量代謝等方面起著重要作用。肌細(xì)胞膜上的Na＋－K＋－ATP酶是維持肌纖維結(jié)構(gòu)和功能的重要蛋白，是細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換的重要系統(tǒng)，對(duì)保持細(xì)胞體積及p H、肌肉和神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜興奮性、腎臟中Na＋和水的重吸收等生理過(guò)程具有重要作用［1］。Ca2＋－Mg2＋－ATP酶主要分布在骨骼肌和心肌的肌漿網(wǎng)上，激活時(shí)可將胞漿中的Ca2＋迅速集聚到肌漿網(wǎng)內(nèi)部，使胞漿中Ca2＋濃度在短期內(nèi)下降到原來(lái)的1／100，這是誘發(fā)肌肉舒張的關(guān)鍵因素。由于肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2＋貯存量增加，還能增加肌肉收縮時(shí)肌漿網(wǎng)釋放更多的Ca2＋，從而加強(qiáng)肌肉的收縮能力［2］。本試驗(yàn)的大通牦牛心肌和骨骼肌線粒體Na＋－K＋ATP，Mg2＋－ATP，Ca2＋－ATP，Ca2＋－Mg2＋ATP 4種酶活性在年齡組間差異均不顯著（P＞0.05），表明大通牦牛在生長(zhǎng)發(fā)育階段能有效的保持Na＋－K＋離子和Ca2＋－Mg2＋離子的代謝平衡。

3.2 牦牛心肌、骨骼肌運(yùn)動(dòng)能力與ATP酶活性的關(guān)系

ATP酶存在于組織細(xì)胞膜及細(xì)胞器的膜上，在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要的作用，因而，ATP酶活性是影響肌肉收縮張力和收縮速率的重要因素。機(jī)體在缺氧或病理狀態(tài)下，ATP酶活力發(fā)生一系列轉(zhuǎn)變，所以ATP酶活力的大小是評(píng)價(jià)各種細(xì)胞能量代謝及功能有無(wú)損傷的重要指標(biāo)。有研究表明，急性缺氧使線粒體氧化磷酸化功能受損，ATP生成減少和ATP酶活性顯著降低［3］。李彤等［4］通過(guò)低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌閏盤(pán)及其線粒體ATP的作用研究，結(jié)果顯示，在急性低氧運(yùn)動(dòng)Na＋，Ca2＋－ATPase顯著下降，經(jīng)過(guò)4周低氧訓(xùn)練適應(yīng)后，心肌線粒體ATP酶活性上升。夏前明等［5］報(bào)道對(duì)當(dāng)腦缺血、缺氧時(shí)，ATP生成減少，細(xì)跑能量代謝障礙，Na＋－K＋－ATP酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)Na＋濃度升高，Na＋－Ca2＋交換增強(qiáng)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷。運(yùn)動(dòng)中乳酸增加，p H下降，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度增加，胞內(nèi)K＋的持續(xù)丟失，胞外Na＋的內(nèi)流，細(xì)胞膜上ATP酶含量的減少等因素都可能會(huì)降低Na＋－K＋－ATP酶的活性和數(shù)量表達(dá)［6］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在同一海拔地區(qū)，大通牦牛心肌、骨骼肌線粒體ATP酶在物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞等方面發(fā)揮著穩(wěn)定的作用。

3.3 牦牛心肌、骨骼肌線粒體ATP酶與年齡的關(guān)系

研究已證實(shí)，在骨骼肌中 Na＋－K＋－ATP酶主要分布在肌細(xì)胞膜，而且不同物種、不同年齡、不同類(lèi)型肌纖維的細(xì)胞膜上Na＋－K＋－ATP酶的濃度不同［7］。有研究報(bào)道，4周齡的老鼠比目魚(yú)肌細(xì)胞膜上 Na＋－K＋－泵的濃度約3 350 mol／μm2，同樣年齡的蛙比目魚(yú)肌細(xì)胞膜上 Na＋－K＋－泵的濃度約2 500 mol／μm2［8］。Suwannachot P 等［9］對(duì)5 歲至成年馬的研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增大，同一骨骼肌細(xì)胞膜上Na＋－K＋－泵的數(shù)量也隨著增加。在豬的同一骨骼肌細(xì)胞膜上Na＋－K＋－泵數(shù)量的變化與年齡沒(méi)有線性關(guān)系［10］。Kjeldsen K 等［11］對(duì)不同年齡的人體股外側(cè)肌細(xì)胞膜上Na＋－K＋－泵的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Na＋－K＋泵數(shù)量與年齡之間也沒(méi)有明顯的關(guān)系。本試驗(yàn)選擇的動(dòng)物是牦牛新品種，具有穩(wěn)定的遺傳性、較高的產(chǎn)肉性能、優(yōu)良的抗逆性及對(duì)高山高寒草場(chǎng)的利用性強(qiáng)等特點(diǎn)。從4個(gè)年齡組的測(cè)定數(shù)據(jù)顯示，大通牦牛心肌、骨骼肌線粒體ATP酶的代謝水平與其年齡之間無(wú)明顯的線性關(guān)系。

［1］郭曉強(qiáng).Na＋－K＋－ATP酶γ亞基的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2005，26（6）：369－371.

［2］Kimura Y，Otsu K，Nishida K，et al.Thyroid hotmone enhances Ca－pumping activity of the cardiac satcoplasmic reticulum by increasing Ca2＋ATPase and decreasing phospholanlban expression［J］.J Molc Cardio，1994，26（2）：1145－1154.

［3］高文祥，柳君澤，吳利平，等.急、慢性缺氧對(duì)大鼠腦線粒體能量代謝的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2000，16（10）：879－882.

［4］李 彤.低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌閏盤(pán)及其線粒體ATP酶的作用［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（9）：62－64.

［5］夏前明，李福祥，全 燕，等.低氧習(xí)服過(guò)程中肺組織一氧化氮水平及鈉－鉀－ATP酶活性的變化［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9（2）：104－106.

［6］安志紅，陳靜寧.運(yùn)動(dòng)與骨骼肌 Na＋－K＋－ATP酶［J］.四川體育科學(xué)，2007，12（4）：59－63.

［7］Williams M R W，Resneck W G，Kaysser T.Na，K－ATPase in skeletal muscle：two populations ofβ－spectrin control localization in the sarcolemma but not partitioning between the sarcolemma and the transverse tubules［J］.J Cell Sci，2001，114：751－762.

［8］Venosa R A，Horowicz P.Density and apparent location of the sodium pump in frog sartorius muscle［J］.J Membr Biol，1981，59：225－232.

［9］Suwannachot P，Verkleij C B，Weijs W A，et al.Effects of training on the concentration of Na＋，K＋－ATPase in foal muscle［J］.Equine Vet J，1999，31：101－105.

［10］Dauncey M J，Clausen T，Harrison A P.Developmental regulation of Na＋，K＋－and Ca2＋－ATPases in muscle［J］.Modern Trends Biothermokinetics，1994，3：163－168.

［11］Kjeldsen K，Gron P.Skeletal muscle Na，K－pump concentration in children and its relationship to cardiac glycoside distribution［J］.J Pharmacol Exp Ther，1989，250：721－725.