張鵬飛，呂瓊霞，劉玉梅，鄧 雯，陳曉光，王艷杰

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽471003）

檸檬酸（citric acid，CA）屬于天然的有機(jī)酸，作為酸化劑能降低飼料酸堿度，提高飼料的適口性，并能提高機(jī)體消化酶活性［1］，因其具有抗菌和抑菌作用，可以調(diào)節(jié)畜體腸道有益菌群的平衡，具有促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)的作用［2］；作為抗氧化輔劑能夠防止飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的氧化而用于飼料的儲(chǔ)存［3］。此外，檸檬酸作為三羧酸循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物，連接著糖酵解和三羧酸循環(huán)，對(duì)糖和脂肪代謝有極為重要的作用，通過線粒體中的氧化為機(jī)體提供足夠的能量。

需氧生物在氧化還原過程中往往產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫等活性氧。少量的自由基是生物體所必需的，作為第2信使，對(duì)信號(hào)的傳導(dǎo)起重要作用，并影響基因的表達(dá)。但過多的自由基如果不能被及時(shí)消除，將會(huì)攻擊各種生物大分子，引起DNA損傷、酶失活、脂質(zhì)過氧化等一系列氧化損傷，進(jìn)而引起生物體的各種生理病變［4］。已有的研究表明，檸檬酸能夠引起大鼠腎臟功能損害，血清肌酐和尿素氮顯著或極顯著增加［5］；使雞和小鼠的肝臟損傷，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞質(zhì)空泡變性、細(xì)胞核膜內(nèi)陷和肝細(xì)胞壞死，血清乳酸脫氫酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶等升高［6－7］；長(zhǎng)時(shí)間給家兔飼喂添加檸檬酸（約5%）日糧，會(huì)使睪丸管周會(huì)產(chǎn)生少量纖維化，間質(zhì)輕微玻璃樣變性［8］。另有研究顯示，檸檬酸能夠引起小鼠肝臟組織的總過氧化物歧化酶（to－tal superoxide dismutase，T－SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）活性顯著降低，造成肝臟氧化應(yīng)激［9］。盡管睪丸組織對(duì)機(jī)體內(nèi)的氧化自由基更為敏感，但由于睪丸組織及精液中檸檬酸的含量較其他組織高出許多，因此，外源性檸檬酸的過多攝入是否會(huì)引起睪丸組織的氧化應(yīng)激，未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用腹腔注射染毒，通過測(cè)定小鼠睪丸組織SOD、GSH－Px、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、總一氧化氮合酶（total nitric oxide synthase，T－NOS）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，探討檸檬酸是否會(huì)引起睪丸的氧化應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明系小鼠40只，體重（20±2）g，購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院。

1.1.2 主要試劑 檸檬酸，分析純，天津市化學(xué)試劑廠；SOD、GSH－Px、LDH、T－NOS、MDA檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組10只，即對(duì)照組（生理鹽水）和檸 檬 酸 低 （180mg／kg）、中 （270mg／kg）、高（360mg／kg）劑量組。分別經(jīng)腹腔注射途徑給予相應(yīng)處理，每只0.2mL，每周1次，連續(xù)注射3周，第3次注射后的第7天，將受試小鼠頸椎脫臼處死，取其睪丸并剔除脂肪等多余組織，制備10%的勻漿液，離心后取上清液備用。飼養(yǎng)期間小鼠自由采食和飲水，隔天更換小鼠墊料，且每天保持飼養(yǎng)室通風(fēng)透氣。

1.2.2 小鼠睪丸組織SOD、GSH－Px、LDH、NOS活性和MDA含量的測(cè)定 取制備好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100g／L的小鼠睪丸組織勻漿液，按試劑盒說明，分別采用黃嘌呤氧化酶法、DTNB法、丙酮酸－二硝基苯腙法、精氨酸法、TBA法分別測(cè)定勻漿中SOD、GSH－Px、LDH、NOS的活性和MDA的含量。

1.2.3 數(shù)據(jù)的處理 試驗(yàn)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并應(yīng)用SPSS 11.5進(jìn)行單因素方差分析。組間差異顯著性采用LSD檢驗(yàn)法，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織SOD活性的影響

小鼠睪丸組織SOD活性檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織SOD活性的影響Table 1 Effects of CA on testicular SOD activities in mice

由表1可見，隨著檸檬酸濃度的升高，小鼠睪丸組織SOD活性呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，檸檬酸中、高劑量組小鼠睪丸組織的SOD活性顯著降低（P＜0.05）；且檸檬酸低與高劑量組間呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。

2.2 檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織GSH－Px活性的影響

由表2可知，檸檬酸低、中、高劑量組小鼠睪丸組織的 GSH－Px活性均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），檸檬酸各處理組間GSH－Px活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異（P＞0.05）。

表2 檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織GSH－PX活性影響Table 2 Effects of CA on testicular GSH－PX in male mouse

2.3 檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織T－NOS活性的影響

小鼠睪丸組織T－NOS活性檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織T－NOS活性影響Table 3 Effects of CA on testicular T－NOS activities in mice

由表3可知，與對(duì)照組相比，不同濃度檸檬酸處理后，小鼠睪丸組織T－NOS活性均無顯著變化（P＞0.05），但隨著檸檬酸濃度的升高，T－NOS活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與對(duì)照組相比分別增加2.1%、5.5%和18.3%。

2.4 檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織MDA含量的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，檸檬酸各處理組小鼠睪丸組織MDA含量均顯著降低（P＜0.05）；隨著檸檬酸濃度的升高，MDA含量呈下降趨勢(shì)，檸檬酸高劑量組MDA含量顯著低于檸檬酸低、中劑量組（P＜0.05）。說明細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化隨檸檬酸濃度的升高而降低。

2.5 檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織LDH活性的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，不同濃度檸檬酸處理后，小鼠睪丸組織LDH活性均無顯著變化（P＞0.05），但隨著檸檬酸濃度的升高，LDH 活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，分別比對(duì)照組降低8%、8.6%和10.4%。

表4 檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織MDA含量影響Table 4 Effects of CA on testicular MDA activities in mice

表5 檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織LDH活性影響Table 5 Effects of CA on testicular LDH activities in mice

3 討論

機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生自由基，攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物。氧自由基不但通過生物膜中的多不飽和脂肪酸的過氧化引起細(xì)胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷，造成MDA等脂質(zhì)過氧化物的堆積。因此，組織中MDA的量常用來反映機(jī)體內(nèi)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。SOD是一種機(jī)體防御氧化損傷的酶，通過清除機(jī)體氧化反應(yīng)產(chǎn)生的O2－阻斷脂質(zhì)過氧化作用，解除超氧陰離子對(duì)生物體細(xì)胞的損傷，起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用。GSH－Px對(duì)防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化特別重要，對(duì)氫過氧化物具有相對(duì)的專一性，能夠催化過氧化氫（H2O2）與GSH反應(yīng)生成水及氧化型谷光甘肽，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能免受過氧化物的干擾及過氧化損害。機(jī)體內(nèi)的GSHPx、SOD受外界刺激或細(xì)胞老化的影響，其含量會(huì)大幅降低，進(jìn)而導(dǎo)致器官功能衰退。在自由基堆積時(shí)，血液的GSH、SOD等酶的活性下降或其作用的還原性底物含量減少。

李成文等［10］通過草酸對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的研究表明，草酸對(duì)體外培養(yǎng)的Wistar大鼠腎小管上皮細(xì)胞可造成脂質(zhì)過氧化損傷，而外源性檸檬酸具有減輕這種脂質(zhì)過氧化損傷的作用，本研究的結(jié)果與此基本一致。研究結(jié)果顯示，隨檸檬酸劑量的增加，小鼠睪丸組織內(nèi)的MDA含量顯著降低。但本研究中MDA含量降低的結(jié)果僅能說明檸檬酸能夠降低睪丸組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，但并不代表睪丸細(xì)胞總體抗氧化能力的增強(qiáng)。因?yàn)?，研究結(jié)果同時(shí)顯示SOD、GSH－Px活性顯著降低。這種結(jié)果表明，檸檬酸處理后睪丸組織由SOD途徑清除自由基O2－能力的降低；由GSH的還原作用呈現(xiàn)的對(duì)抗膜脂質(zhì)過氧化能力也減弱。即檸檬酸對(duì)SOD、GSH－Px抗氧化酶系統(tǒng)的抗氧化作用呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。張自強(qiáng)等［9］在研究檸檬酸對(duì)小鼠肝臟的氧化應(yīng)激時(shí)也有類似的結(jié)果。值得關(guān)注的是，本研究中小鼠睪丸組織T－NOS活性隨著檸檬酸劑量的增加呈上升趨勢(shì)，據(jù)此推測(cè)睪丸組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA含量的降低，不是經(jīng)SOD、GSH－Px抗氧化酶系統(tǒng)途徑完成，而可能是通過NO途徑實(shí)現(xiàn)的。NOS是合成NO的限速酶，NO可以影響多種細(xì)胞的功能，在生理劑量下通過NO－cGMP途徑發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)，尤其是能夠舒張組織血管，改善血液局部微循環(huán)。而在病理狀態(tài)下，各種刺激因子導(dǎo)致誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的過度表達(dá)，生成大量NO，在引起非特異性免疫作用的同時(shí)，對(duì)周圍環(huán)境中的正常細(xì)胞也產(chǎn)生毒性效應(yīng)［12］。研究顯示，大量NO產(chǎn)生可引起腎組織損傷［13］；但在急性肝臟病變時(shí)，局部升高的NO可避免氧自由基損害肝細(xì)胞，有助于肝臟渡過應(yīng)激期，對(duì)肝細(xì)胞起保護(hù)作用［14－15］；在脂肪肝模型中，NO能夠改善肝臟的微循環(huán)，減少HbO2和細(xì)胞色素C氧化酶的含量，增加脂肪肝膽固醇的氧化，降低肝臟細(xì)胞損傷［16］。1995年，Rosseli M等［17］首次證實(shí)，硝普鈉分解產(chǎn)物NO使精子活力下降，NO的滅活劑血紅蛋白則抑制該種效應(yīng)。較低劑量下，NO促進(jìn)精子運(yùn)動(dòng)的機(jī)制目前仍不清楚。Hellstom W J等［18］認(rèn)為，NO對(duì)氧自由基的捕捉使精子脂膜脂質(zhì)過氧化水平下降，本研究與Hellstom W J持相同的觀點(diǎn)。但亦有人認(rèn)為可能與NO存在的氧化還原狀態(tài)有關(guān)，因其狀態(tài)不同，可以對(duì)細(xì)胞起破壞或保護(hù)作用。田溪泉等研究了NO對(duì)精子運(yùn)動(dòng)功能的影響，揭示NO對(duì)精子功能調(diào)節(jié)具有劑量依賴效應(yīng)。NO對(duì)精子存在兩種效應(yīng)，一是NO通過NO－cGMP途徑對(duì)精子功能的調(diào)節(jié)，可以顯著提高精子的功能，對(duì)精子起保護(hù)作用；另外，NO與呼吸鏈代謝生成的超氧離子反應(yīng)生成劇毒的過氧化亞硝酸根離子（ONOO－），其對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力下降。本研究中，NOS活性隨檸檬酸濃度增加呈上升趨勢(shì)的結(jié)果說明，睪丸組織內(nèi)的NO生成量當(dāng)呈增加趨勢(shì)，結(jié)合睪丸組織中MDA含量降低的變化，可以推測(cè)NO在本研究中主要表現(xiàn)抗氧化保護(hù)作用。這種保護(hù)作用除了通過NO對(duì)氧自由基的捕捉使精子脂膜脂質(zhì)過氧化水平下降外，還有可能通過增加睪丸的血液供應(yīng)，及時(shí)輸出睪丸組織的毒性物質(zhì)，從而降低對(duì)睪丸組織細(xì)胞的損傷。

正常情況下，組織細(xì)胞內(nèi)LDH活性較高，而血清中的活性較小，較高的LDH活性，可以加速乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，減少組織中乳酸的積累，降低乳酸對(duì)機(jī)體的損害。而當(dāng)組織發(fā)生病變時(shí)，就會(huì)大量進(jìn)入血液，使血清中LDH活性升高，組織中的活性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著檸檬酸濃度的升高，小鼠睪丸組織LDH活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，預(yù)示隨檸檬酸劑量增大，睪丸細(xì)胞膜的通透性可能會(huì)增加，使細(xì)胞膜的穩(wěn)定性受到一定影響。

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