王軍一，金擴世，徐敬龍

（1.臨沂市畜牧站，山東臨沂276004；2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春130041；3.濟南澳利生物工程有限公司，山東濟南250306）

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV－2）和豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）可以引起以妊娠母豬流產、早產、產死胎及木乃伊胎等為特征的繁殖障礙性疫病，是當前嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要病原。這些病原除了可以通過接觸傳播外，更能通過交配或精液輸入而擴散。

目前，規(guī)模豬場普遍采用人工授精技術，2007年，國家大力實施生豬良種繁育補貼項目，進一步推廣人工授精技術。因此，如果公豬精液攜帶這些病原，則很容易通過精液傳播，從而加大了病原傳播的速度和廣度，增加了防控工作的難度和復雜性。為了解山東地區(qū)種公豬精液的帶毒情況，為制定科學有效的防控措施提供依據，應用PCR技術對山東部分種豬場或人工授精站公豬精液進行了上述5種病毒的檢測，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 公豬精液樣品 從2007年－2009年共采集來自山東各地38個豬場和人工授精站的生產公豬精液樣品727份，其中包括種豬場11個423份，普通規(guī)模豬場13個258份，人工授精站14個46份。

1.1.2 主要試劑 M－MLV反轉錄酶、RNA 酶抑制劑、Ex－Taq DNA 聚合酶、d NTPs、DNA 標準，以及病毒核酸提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 PCR引物 CSFV采用羅廷榮等［1］報道的引物，CSFV1：5′－GCT CCT GGT TGG TAA CCT CGG－3′；CSFV2：5′－TGA TGC TGT CAC ACA GGT GAA－3′，預計擴增目的片段長度分別為508 bp。

PRRSV 采用婁高明等［2］報道的引物，PRRSV1：5′－ATG GCC AGC CAG TCA ATC A－3′；PRRSV2：5′－TCG CCC TAA TTG AAT AGG TG－3′，預計擴增目的片段長度為433 bp。

PRV引物采用豬偽狂犬病病診斷技術標準（GB／T18641－2002），預計擴增目的片段長度為217 bp。

PCV－2采用蘆銀華等［3］報道的引物，PCV－2 1：5′－CCG CGG GCT GGC TGA ACT T－3′；PCV－2 2：5′－ACC CCCGCC ACC GCT ACC－3′，預計擴增目的片段長度為1 154 bp。

PPV 采用趙俊龍等［4］報 道 的引物，PPV1：5′－TGG TCT CCT TCT GTG GTA GG－3′；PPV2：5′－CAG AAT CAG CAA CCT CAC－3′，預計擴增目的片段長度為445 bp。

引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 精液樣品的前處理與病毒核酸提取 用PBS（p H 7.4，0.01 mol／L）將精液樣品做10倍稀釋，反復凍融3次，4℃、12 000 r／min離心10 min。取250μL上清按照 TaKaRa MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit試劑盒說明書提取病毒核酸。

1.2.2 病原檢測 CSFV和PRRSV檢測采用同一RT－PCR反應條件，反轉錄體系：5×buffer 5μL，d NTP（2.5 mmol／L）4μL，RNasin 0.5μL，M－MLV反轉錄酶0.5μL，反轉錄引物1μL，模板 RNA 16μL。反轉錄反應條件為42℃反應1 h。PCR反應體 系 如 下：上 下游引物 各 0.5μL，d NTP（2.5 mmol／L）2μL，10×buffer 2.5μL，DNA 模板2μL，Taq酶0.3μL（5 U／μL），用滅菌雙蒸水加至總體積25μL。PCR反應條件：95℃5 min；95℃40 s，57℃40 s，72℃1 min，35個循環(huán)；然后72℃延伸10 min。PRV檢測參考豬偽狂犬病病診斷技術標準（GB／T18641－2002）［3］進行；PCV－2參照蘆銀華［4］介紹的PCR 方法進行；PPV 參照趙俊龍［5］介紹的PCR方法進行。取5μL PCR產物在12 g／L的瓊脂糖凝膠上進行電泳（100 V，30 min），應用凝膠成像系統觀察目的片段。

2 結果

2.1 公豬精液中5種主要病原的檢測結果

727份公豬精液樣品中檢出18份CSFV陽性樣品，陽性率2.48%，來自4個種豬場、4個普通規(guī)模豬場和1個人工授精站；檢出27份PRRSV陽性樣品，陽性率3.71%，來自4個種豬場、7個普通規(guī)模豬場和2個人工授精站；檢出7份PRV陽性樣品，陽性率0.96%，來自2個種豬場和3個普通規(guī)模場；檢出33份PCV－2陽性樣品，陽性率4.54%，來自4個種豬場、7個普通規(guī)模豬場和2個人工授精站；檢出9份PPV陽性樣品，陽性率1.24%，分別來自2個種豬場和3個普通規(guī)模豬場。結果表明有44.74%的豬場精液帶毒（17／38），只有6個種豬場，5個普通規(guī)模豬場和10個人工授精站的公豬精液中未檢出病原。具體見表1，表2，表3和圖1。

表1 公豬精液中5種病原檢測總體情況Table1 The results of 5 pathogen detection in boar semen

表2 種豬場公豬精液中5種病原檢測結果Table2 The results of 5 pathogen detection in boar semen of stock farms

表3 普通規(guī)模豬場公豬精液中5種病原檢測結果Table3 The results of 5 pathogen detection in boar semen of the ordinary scaled farms

2.2 公豬精液中5種病原混合感染的檢測結果

公豬精液中5種病原混合感染的檢測結果見表4，有7份樣品為2種以上病原混合感染，陽性場次數達6個，其中以PRRSV＋PCV－2混合感染最多，有4份（包括三重感染），陽性場次數達3個。另外，CSFV與其他病原混合感染情況也比較突出，有18份CSFV陽性樣品中有3份為混合感染，比率高達16.67%。

表4 精液中5種病原混合感染的檢測結果Table4 The results of 5 pathogen mixed infection detected in the boar semen

3 討論

在生豬生產實踐過程中，優(yōu)良種公豬可以給大量的母豬配種，人工授精技術的推廣和廣泛應用進一步凸顯出公豬精液的疫病防控中的源頭地位。很多疫病如豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合癥、豬細小病毒病、偽狂犬病、圓環(huán)病毒等都很能夠通過公豬精液傳播與擴散，造成疫病的流行。國內一些單位也先后對公豬精液攜帶病毒情況進行了檢測。如南京農業(yè)大學的周斌等［5］對2003年－2004年期間華東5省市17個大中型豬場送檢的186份中公豬精液進行了檢測，結果18份呈PRRSV陽性，24份為CSFV陽性，其中11份為PRRSV和CSFV混合感染。孫泉云等［6］在2006年4月～10月對上海及周邊30個豬場和授精站355份公豬精液進行了6種與繁殖障礙相關病毒的檢測，結果除日本腦炎病毒為陰性外，PRRSV、PRV 、CSFV、PPV 和 PCV 均有一定程度流行，并存在混合PRV和PPV感染現象。黃夏等［7］對采自廣西6市12個種豬場的441份公豬精液進行檢測，結果有75%的豬場公豬精液存在帶毒現象，CSFV、PRRSV、PCV－2、PRV 和PPV 陽性率分別為10.20%、2.04%、7.48%、0.45%和0.45%，總陽性率為20.63%。

本試驗采用PCR技術，對2007年－2009年采集的山東11個種豬場、13個普通規(guī)模豬場和14個人工授精站的共計727份生產公豬精液樣品進行了檢測，結果發(fā)現無論是種豬場、普通規(guī)模場，還是授精站的公豬精液均存在帶毒現象，共檢出陽性樣品94份，陽性率為12.93%；其中PCV－2和PRRSV陽性率最高，分別為4.54%和3.71%；其次是CSFV，陽性率達2.48%；而PRV和PPV也有一定水平帶毒，陽性率分別為0.96%和1.24%；另外發(fā)現存在PRRSV、PCV－2和CSFV、PPV等混合感染現象，陽性率為0.96%。

與其他單位研究結果不同的是，本研究發(fā)現山東地區(qū)公豬精液中PRRSV和PCV－2陽性率最高，而黃夏等［7］報道CSFV檢出率最高，孫泉云等［6］則發(fā)現PPV陽性率最高。造成這種原因，我們考慮是首先2006年下半年－2008年全國流行高致病性藍耳病，在此期間不少豬場的公豬被感染，因此精液陽性率較高，而其他研究者的工作在疫情暴發(fā)前已基本完成，因此，PPRSV的陽性率存在較大差異。由于目前缺乏有效的商品化疫苗，防控PCV－2主要通過嚴格的生物安全管理和檢疫凈化等措施，因此管理水平的差距是造成不同地區(qū)、豬場PCV－2陽性率差異的關鍵。本試驗結果發(fā)現，PRRSV和PCV－2，以及與其他病原混合感染現象較為普遍。由于PRRSV和PCV－2是免疫抑制性疫病，主要破壞機體免疫系統，因此對這兩種疫病的防控應高度重視。

種公豬和公豬精液的質量直接關系到養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，在當前豬病日趨復雜化的形勢下，必須加強對種公豬和精液的管理。種豬場和規(guī)模豬場應建立完善的生物安全體系，減少疫病傳播幾率，提高豬群的整體健康水平；應加強對公豬群的疫病監(jiān)測，盡早發(fā)現和剔除感染病毒的陽性種公豬，徹底切斷傳染源。另外，豬場和授精站在引進種公豬和精液前必須嚴格檢疫（測），選用無特定病原的公豬或精液用于授精，充分保證養(yǎng)殖場（戶）的經濟效益，從而從種源上凈化繁殖障礙性疾病奠定基礎。

［1］羅廷榮，莫 揚，吳文德，等.RT－PCR技術診斷豬瘟的應用研究［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2004，26（4）：307－310.

［2］婁高明，杜偉賢，謝明權，等.豬繁殖與呼吸道綜合征RT－PCR診斷方法的建立［J］.中國獸醫(yī)學報，2000，20（2）：141－144.

［3］蘆銀華，許立華，華修國，等.豬圓環(huán)病毒2及豬繁殖與呼吸綜合征病毒的快速檢測［J］.中國病毒學，2003，18（2）：184－186.

［4］趙俊龍，陳煥春，呂建強，等.豬細小病毒PCR檢測方法的建立與應用［J］.中國獸醫(yī)學報，2003，23（2）：142－144.

［5］賈 斌，蘆銀華，張素芳，等.豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬細小病毒混合感染的流行病學調查［J］.中國病毒學，2004，19（5）：467－470.

［6］孫泉云，周錦萍，張維誼，等.種公豬精液中與繁殖障礙有關的6種病毒的檢測［J］.動物醫(yī)學進展，2007，28（11）：30－33.

［7］黃 夏，陳義祥，磨龍春，等.應用PCR方法對廣西公豬精液的偽狂犬病、圓環(huán)病毒2型和細小病毒混合感染情況的檢測［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2008，33（1）：41－43.