王 慧，王開功，張雙翔，周碧君，文 明，程振濤，龍沖沖，尹 鑫，羅 意

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省動(dòng)物疫病研究室，貴州貴陽550025）

山羊傳染性胸膜肺炎（Contagious caprine plneuropneumonia，CCPP）是由綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，Mo）及絲狀支原體山羊亞種（Mycoplasma mycoides subsp.capri，Mmc）等絲狀支原體簇致病支原體所引起的山羊的高度接觸性傳染病，為國家二類傳染病，臨床癥狀為高熱、咳嗽、肺和胸膜發(fā)生漿液性和纖維蛋白性炎癥，病死率較高［1－5］。自1947年我國首次在甘肅發(fā)現(xiàn)山羊患此病后，在我國內(nèi)蒙古、寧夏、新疆、遼寧、河北、四川、重慶、廣西、貴州、湖南等多個(gè)地區(qū)均有山羊傳染性胸膜肺炎的報(bào)道［6－9］，對我國養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的沖擊。

立秋以后，貴州省某規(guī)模化山羊養(yǎng)殖場所飼山羊不斷暴發(fā)臨床表現(xiàn)為咳嗽、消瘦、高熱、臥地不起等類似山羊傳染性胸膜肺炎的疾病，造成了大量山羊死亡，妊娠母羊并發(fā)流產(chǎn)，流產(chǎn)率高達(dá)20%～25%，影響了當(dāng)?shù)氐男竽两?jīng)濟(jì)發(fā)展。為確診病因，對臨床病死母羊以分子生物學(xué)方法進(jìn)行病原檢測，最終確診為CCPP，并對流產(chǎn)情況進(jìn)行分析，現(xiàn)將病例診斷情況介紹如下，以期為預(yù)防控制疫病流行暴發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采自貴州省某規(guī)?；窖蝠B(yǎng)殖場臨床表現(xiàn)疑似CCPP癥狀并發(fā)流產(chǎn)死亡3只母山羊病變肺組織與子宮。

1.1.2 試劑 DNA提取試劑及PCR擴(kuò)增試劑購自北京天根生化科技有限公司；分子克隆試劑購自大連TaKaRa公司；Mmc PG3株與Mo Y98株16S rRNA基因部分序列克隆質(zhì)粒，由貴州省動(dòng)物疫病研究室制備保存；山羊流產(chǎn)衣原體疫苗購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 參考文獻(xiàn)［10］設(shè)計(jì)擴(kuò)增CCPP主要病原Mmc 16SrRNA部分序列的特異性 引 物 Ps／Pa（Ps：5′－GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT－3′， Pa： 5′－CAGCGTCAATAACAAGCCAGTAAG－3′，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度412bp）與 Mo 16S rRNA 部 分 序 列 的 特 異 性 引 物 Ms／Ma（Ms：5′－AAACTATGTGCCAGCAGCGTAAG－3′，Ma：5′－CACCATCTGTCATCTCGTTAGCC－3′，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度534bp）；并參考GenBank中公布的山羊流產(chǎn)衣原體OmpA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物P1／P2（P1：5′－ATGAAAAAA CTCTTGAAATCG－3′，P2：5′－TTAGAATCTGAATTGAGCA－3′，預(yù) 期 產(chǎn)物大小1 170bp）。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2 CCPP病原核酸檢測 取3只病死母羊肺組織無菌研磨成組織勻漿液，以10 000r／min離心10min后取上清液，采用SDS－Protein K法提取病料組織基因組DNA。用引物Ps／Pa與Ms／Ma以所提DNA為模板進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增：于50μL反應(yīng)體系中加入10×buffer 5μL，Mg2＋（25mmol／L）3μL，dNTP（10mmol／L）1μL，Taq酶（2.5U／μL）1μL，引 物 Ps／Pa（10 μmol／ L）及 Ms／Ma（10μmol／L）各1μL，DNA模板1μL，ddH2O補(bǔ)足。94℃預(yù)變性4min；94℃變性40s，54℃退火40s，72℃延伸1.5min，共34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。以10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 山羊流產(chǎn)衣原體核酸檢測 取3只病死母羊子宮組織無菌研磨成組織勻漿液，以10 000r／min離心10min后取上清液，采用SDS－Protein K法提取病料組織基因組DNA。用引物P1／P2以所提DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：于50μL反應(yīng)體系中加入10×buffer（含 Mg2＋）5μL，dNTP（10mmol／L）1μL，Taq酶（2.5U／μL）1μL，引物P1／P2（10μmol／L）各1μL，DNA模板2μL，ddH2O補(bǔ)足。94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，53℃退火40s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。以10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 目的基因克隆測序 取擴(kuò)增產(chǎn)物按文獻(xiàn)［11］進(jìn)行目的基因純化回收并T載體克隆，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR與雙酶切鑒定初步判為陽性者送測序公司進(jìn)行序列測定。

1.2.5 序列比對分析 以生物軟件將測定序列結(jié)果與CCPP病原山羊支原體山羊肺炎亞種（M.capricocumsubsp.capripreumoniae，Mccp）、絲狀支原體絲狀亞種LC型（M.mycoides subsp.mycoides LC，Mmm LC）、絲狀支原體山羊亞種（M.mycoides subsp.capri，Mmc）及綿羊肺炎支原體（M.ovipneumoniae，Mo）16SrRNA 基因進(jìn)行同源性分析；為進(jìn)一步分析病例所伴流產(chǎn)率高的原因，將測定序列結(jié)果與感染生殖道、易引起流產(chǎn)的解脲支原體（U.urealyticum，Uu）、狗生殖道尿原體（U.canigenitalium，Uca）、人型支原體 （M.hominis，Mho）、腐敗支原體（M.putrefaciens，Mpu）、眼無膽支原體（A.oculi，Aoc）、相異尿原體（U.diversum，Ud）、貍貓尿原體（U.felinum，Uf）和雞口尿原體（U.gallorale，Ug）的16SrRNA 序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析，參比序列見表1。

表1 參比序列Table 1 The GenBank accession No of reference sequences

2 結(jié)果

2.1 CCPP病原核酸檢測結(jié)果

用引物Ps／Pa與Ms／Ma以從3只病死母羊肺組織提取的基因組DNA為模板進(jìn)行Mmc和16S rRNA雙重PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。由圖1可知，從3只病死母羊肺組織所提基因組DNA中未擴(kuò)增到Mmc 16SrRNA基因412bp片段，均擴(kuò)增到Mo 16SrRNA基因534bp片段，表明病死母羊已患CCPP，初步判定為Mo感染所致。

2.2 山羊流產(chǎn)衣原體核酸檢測結(jié)果

用引物P1／P2以從3只病死母羊子宮組織提取的基因組DNA為模板進(jìn)行山羊流產(chǎn)衣原體OmpA基因PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。由圖2可知，從3只病死母羊子宮組織所提基因組DNA中均未擴(kuò)增到山羊流產(chǎn)衣原體OmpA基因1 170bp片段，表明病死流產(chǎn)母羊未感染山羊流產(chǎn)衣原體。

2.3 擴(kuò)增片段序列與CCPP病原支原體16S rRNA同源性分析結(jié)果

對2.1擴(kuò)增出的基因片段進(jìn)行回收純化，克隆到T載體后進(jìn)行序列測定，測定結(jié)果為3個(gè)樣品序列相同。將序列測定結(jié)果與所有致山羊患CCPP支原體Mccp、Mmm、Mmc及 Mo的16SrRNA進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，所測序列（貴州，GZ）與 Mo同源性高達(dá)99.6%，而與其他3種絲狀支原體簇成員同源性皆低于70%，表明本次造成母羊患CCPP病原確診為Mo。

2.4 擴(kuò)增片段序列與感染生殖道支原體及尿原體16SrRNA分子進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果

將序列測定結(jié)果與感染生殖道、易引起流產(chǎn)的支原體及尿原體16SrRNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，本次致病的病原與感染人、犬、貓、雞生殖道的尿原體進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，而與感染山羊的Aoc與Mpu有一定進(jìn)化相似處，與Mho 16SrRNA基因分子進(jìn)化關(guān)系較近，系統(tǒng)發(fā)生樹顯示二者處于同一分支。

圖1 雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of duplex－PCR

圖2 山羊流產(chǎn)衣原體OmpA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification of OmpA gene of Chlamydia

圖3 與CCPP所有致病支原體同源性比較Fig.3 Comparison of homologies with other mycoplasma

圖4 與生殖道支原體及尿原體進(jìn)化關(guān)系分析Fig.4 Phylogenetic trees based on mycoplasma and ureaplasma

3 討論

本試驗(yàn)采用分子生物學(xué)試驗(yàn)對臨床表現(xiàn)咳嗽、消瘦、流產(chǎn)等癥狀病死母羊進(jìn)行了病因確定性診斷，結(jié)果3只病死母羊病變肺組織中Mo核酸檢測均為陽性，子宮組織中山羊流產(chǎn)衣原體核酸檢測均為陰性。以分子克隆方法對目的基因進(jìn)行克隆并將測定序列與引起CCPP以主要支原體16SrRNA序列進(jìn)行同源性分析，表明致山羊表現(xiàn)上述臨床癥狀的病原為Mo，而未發(fā)現(xiàn)病死母羊感染山羊流產(chǎn)衣原體。

16SrRNA是原核生物核糖體30S亞基中一個(gè)古老而穩(wěn)定的組分，不會(huì)發(fā)生不同生物間水平轉(zhuǎn)移，其基因序列由保守區(qū)和可變區(qū)兩部分組成，保守區(qū)與變異區(qū)共存的獨(dú)特分子進(jìn)化格局使16SrRNA基因序列成為微生物鑒定分類中的重要科學(xué)指標(biāo)，已得到多數(shù)人認(rèn)可［10－13］。本試驗(yàn)將序列測定結(jié)果與CCPP致病支原體16SrRNA序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果所測序列與Mo標(biāo)準(zhǔn)Y98株的同源性為99.6%，而與絲狀支原體的同源性均低于70.0%，進(jìn)一步證實(shí)引起母羊患CCPP的病原為Mo。繼萬一元等［14］在貴州省羅甸等地分離到 Mmc后，本試驗(yàn)于貴州省患CCPP山羊組織病料中檢測到Mo，為貴州省養(yǎng)羊業(yè)對CCPP所造成的山羊疾病進(jìn)行重新的認(rèn)識(shí)與定位提供了資料，并且為合理制定預(yù)防措施及根據(jù)本地毒株流行情況進(jìn)行疫苗免疫提供了科學(xué)依據(jù)。

目前，暫無研究報(bào)道致CCPP的病原支原體可致山羊患繁殖障礙疾病，而本次試驗(yàn)所檢測的病死母羊臨床表現(xiàn)除CCPP癥狀外，還伴隨流產(chǎn)發(fā)生。為深入探究CCPP與山羊流產(chǎn)與臨床表現(xiàn)上有何聯(lián)系，本試驗(yàn)將獲得的Mo 16SrRNA序列片段與感染生殖道、易引起流產(chǎn)的支原體及尿原體16S rRNA序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析，結(jié)果Mo與Mho處于同一分支，分子進(jìn)化有共同特征。研究表明［15－17］，Mho可引起女性泌尿生殖道疾病，感染Mho后女性常表現(xiàn)不孕癥及流產(chǎn)，系統(tǒng)發(fā)生樹分析Mo與Mho進(jìn)化關(guān)系最近，其是否也可感染生殖道從而引起山羊發(fā)生流產(chǎn)，有待于進(jìn)一步研究。

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