汪秋鴻，邊 可，張素素，郭瑞珍，王海青

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)1.2008級(jí)臨床醫(yī)療系，2.病理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041)

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤生物學(xué)特性的表現(xiàn)之一，針對(duì)同源性兩種腫瘤轉(zhuǎn)移率不同，和惡性腫瘤早期、晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移的幾率不同等問(wèn)題，本研究選用細(xì)胞間隙連接蛋白43(Cx43)，采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)來(lái)源相同但轉(zhuǎn)移能力卻不同的皮膚基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma.BCC)和皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma.SCC)，檢測(cè)乳腺癌有轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中Cx43蛋白的表達(dá)，探討Cx43與上述腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及生物學(xué)行為的異樣。

1 材料與方法

1.1 受檢標(biāo)本 收集2008年8月至2010年12月遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院病理科的外檢石蠟包埋標(biāo)本，連續(xù)4μm厚切片，每例4張，備用。常規(guī)HE染色，光鏡觀察，確診。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放療和(或)化療。

1.1.1 皮膚 BCC和 SCC組 皮膚BCC 15例，男性6例，女性4例，年齡35～74歲，平均65歲，均發(fā)生在顏面部。SCC組10例，男6例，女4例;年齡17～83歲，平均62.50歲;下肢3例，頭皮4例，耳周及面部各3例，上肢、頸部及腹部各1例。BCC組織學(xué)類型包括有表淺型基底細(xì)胞癌、結(jié)節(jié)型基底細(xì)胞癌和色素性基底細(xì)胞癌，SCC病例均為高分化的鱗狀細(xì)胞癌。

1.1.2 乳腺癌組 25例，均為女性患者。其中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，年齡36～72歲，平均50.4歲，左乳腺5例，右乳腺8例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，年齡40～47歲，平均43歲，左乳腺7例，右乳腺5例，均為同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。組織學(xué)類型包括有浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌。

1.2 試劑 兔抗人Cx43多克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 Cx43的免疫組化染色(S-P法)，以子宮平滑肌組織為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水干燥、透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判斷

1.4.1 陽(yáng)性表達(dá)部位 DAB顯色:CyclinA以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，部分出現(xiàn)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá);CyclinA mRNA以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞;CyclinD1以細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。AEC顯色:CyclinD1mRNA以細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核出現(xiàn)紅色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.4.2 陽(yáng)性表達(dá)半定量積分法 根據(jù)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積來(lái)判定［1］。每例切片在高倍鏡(400倍)下隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞/視野，分別記錄每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其算術(shù)平均值，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分(＜5%=0分，5% ～25%=1分，26%～50%=2分，51% ～75%=3分，＞75%=4分);染色強(qiáng)度計(jì)分(無(wú)色=0分，淡黃色=1分，棕黃色=2分，棕褐色=3分);陽(yáng)性表達(dá)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積來(lái)判定，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色強(qiáng)度得分之積分為4個(gè)等級(jí):0～2分為陰性(－)，3～5分為陽(yáng)性(+)，6～8分為中度陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)?！?分為高表達(dá)，＜6分為低表達(dá)。

1.4.3 表達(dá)面積和灰度值 采用CCD成像結(jié)合圖像分析系統(tǒng)在200倍光鏡下，分析測(cè)定每個(gè)視野的陽(yáng)性染色面積與分析區(qū)域面積比值、平均灰度值(灰度值越大，表明陽(yáng)性細(xì)胞著色越深，蛋白表達(dá)強(qiáng)度越高)［2］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，然后進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cx43蛋白在BCC和SCC中的表達(dá) Cx43蛋白在BCC組織中呈陽(yáng)性或弱陽(yáng)性表達(dá)，在SCC中呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)(見(jiàn)圖1)。BCC和SCC組織中Cx43蛋白的表達(dá)(表達(dá)水平、表達(dá)強(qiáng)度)有顯著性差異(P＜0.01，見(jiàn)表 1)。

圖1 基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌中Cx43蛋白的表達(dá)(IHC×400)

2.2 Cx43蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá) Cx43在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中呈陽(yáng)性或弱陽(yáng)性表達(dá)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)(見(jiàn)圖2)，無(wú)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯高于有轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見(jiàn)表1)。

圖2 無(wú)轉(zhuǎn)移乳腺癌和有轉(zhuǎn)移乳腺癌中Cx43蛋白的表達(dá)(IHC×400)

表1 各組組織中Cx43蛋白的表達(dá)(±s)

表1 各組組織中Cx43蛋白的表達(dá)(±s)

注:PA:代表陽(yáng)性面積/分析區(qū)域面積;OD:代表光密度。

組 別 n Cx43蛋白的表達(dá)PA OD P BCC組SCC組15 10 0.805 ±0.051 0.101 ±0.024 0.52 ±0.061 0.31 ±0.031＜0.01乳腺癌(無(wú)轉(zhuǎn)移)乳腺癌(有轉(zhuǎn)移)13 12 0.803 ±0.042 0.121 ±0.026 0.34 ±0.023 0.28 ±0.031＜0.01

3 討論

惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，而其侵襲轉(zhuǎn)移潛能的高低受多方面因素的影響。Cx43是人體內(nèi)一種主要的細(xì)胞間隙連接蛋白，是近年發(fā)現(xiàn)的新的腫瘤抑制基因［3］，Cx43基因表達(dá)異常及其導(dǎo)致的細(xì)胞間隙連接通訊(gap junctional intercellular communication.GJIC)功能改變與多種腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，GJIC功能降低與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)［4，5］。本組通過(guò)檢測(cè)Cx43蛋白在BCC、SCC、有轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的表達(dá)，獲得有意義的結(jié)果。

BCC和SCC均由皮膚表皮發(fā)生，所以稱之為同源性皮膚惡性腫瘤，但在臨床上，兩種腫瘤的生物學(xué)行為卻完全不一樣。BCC具有生長(zhǎng)緩慢、對(duì)局部組織破壞性、侵襲性很強(qiáng)，卻極少發(fā)生轉(zhuǎn)移的特殊生物學(xué)行為，是所有惡性腫瘤中唯一幾乎不發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤。而SCC病變發(fā)展較快，具有很強(qiáng)的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力，其轉(zhuǎn)移明顯高于BCC。目前，關(guān)于BCC特有生物學(xué)行為相關(guān)方面的研究，越來(lái)越受到人們的關(guān)注和重視。但是，Cx43與皮膚惡性腫瘤的相關(guān)性研究報(bào)道卻較少。2010年郭瑞珍報(bào)道［6］Cx43在皮膚表皮、皮膚瘢痕上皮和瘢痕癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Cx43及其mRNA在皮膚表皮、皮膚瘢痕上皮和瘢痕癌組織中的表達(dá)逐漸降低，而且兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們認(rèn)為與正常皮膚表皮比較，Cx43及其mRNA的低表達(dá)，與瘢痕癌的發(fā)生有相關(guān)性，可能與瘢痕上皮癌變也有相關(guān)性。Cx43蛋白在BCC中的表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度均高于SCC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，這種表達(dá)的差異，提示與SCC比較，BCC中Cx43蛋白高表達(dá)可能與其生長(zhǎng)緩慢及極少轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性有關(guān)，反之，其低表達(dá)可能與SCC的發(fā)生和易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。在BCC中，Cx43的轉(zhuǎn)移抑制作用可能占有重要地位，發(fā)揮了更大的作用。因此，不同轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤組織中，Cx43蛋白表達(dá)的強(qiáng)度不盡相同，其轉(zhuǎn)移能力受GJIC功能強(qiáng)弱的影響。

乳腺癌是婦女發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因。Cx43是人類乳腺組織中主要表達(dá)的連接蛋白之一，Cx43的異常表達(dá)，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移方面均發(fā)揮重要作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面所發(fā)揮的作用目前有不同的研究結(jié)果，多項(xiàng)研究認(rèn)為Cx43與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有密切相關(guān)性，其表達(dá)與腫瘤分化程度呈正相關(guān)，而與腫瘤惡性進(jìn)程和轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)［7，8］。本組在有轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移的乳腺癌癌組織中檢測(cè)Cx43蛋白，得出的結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，即Cx43的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān) 。Cx43與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，分析其可能的機(jī)制是Cx43表達(dá)異常導(dǎo)致間隙連接(GJ)或GJIC異常，腫瘤細(xì)胞間的結(jié)合力下降，并能逃避正常生長(zhǎng)控制及免疫監(jiān)視，從而易于生長(zhǎng)擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。也有認(rèn)為Cx43在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)可能與啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。本組研究結(jié)果提示，腫瘤生長(zhǎng)的不同時(shí)期其轉(zhuǎn)移潛能不一樣，腫瘤晚期轉(zhuǎn)移潛能的增強(qiáng)，受GJIC功能逐漸減弱的影響。

綜上所述，Cx43的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。但是，CX43在腫瘤轉(zhuǎn)移方面所發(fā)揮的作用也有不同的研究結(jié)果，國(guó)內(nèi)明佳等［9］探討微小RNA－206(miR－206)和連接蛋白(Cx)43在乳腺癌原發(fā)灶(PTs)及腋窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)(MLNs)中的表達(dá)變化關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PTs相比較，MLNs中miR－206的mRNA表達(dá)較 PTs低(P＜0.05)，而 Cx43蛋白的表達(dá)較 PTs明顯增加(P＜0.05)，在 PTs和MLNs中Cx43mRNA的表達(dá)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們認(rèn)為在乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中，Cx43與微小RNA基因的相互作用可能與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是多個(gè)因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，Cx43基因與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的相關(guān)性，除了蛋白水平的異常表達(dá)外，可能還有Cx基因突變，CxmRNA表達(dá)降低或異常表達(dá)等多方面的分子機(jī)制［10］，這些均有待于進(jìn)一步深入研究。

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