劉 健，陶雅君，陳英杰，楊茹虹

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，遼寧大連 116622)

p53、C-erbB-2、VEGF-C和 nm23在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

劉 健，陶雅君，陳英杰，楊茹虹

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，遼寧大連 116622)

［目的］探討p53、C-erbB-2、VEGF-C和 nm23在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義。［方法］應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)100例乳腺癌組織及其癌旁正常乳腺組織活性標(biāo)本中p53、C-erbB-2、VEGF-C和 nm23蛋白表達(dá)情況。［結(jié)果］乳腺癌組織和癌旁正常組織中p53、C-erbB-2、VEGF-C和 nm23蛋白陽性表達(dá)率分別為86.0%和30.0%、76.7%和25.0%、80.0%和20.0%，30.0%和90.0%;p53和 C -erbB -2蛋白陽性表達(dá)在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同臨床分期和癌分化程度上差異有顯著性意義(P＜0.05);VEGF-C蛋白陽性表達(dá)在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和癌分化程度上差異有顯著性意義(P＜0.05);nm23蛋白陽性表達(dá)在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上差異有顯著性意義(P＜0.05)。［結(jié)論］p53、C-erbB-2和VEGF-C陽性表達(dá)是乳腺癌患者預(yù)后差的指標(biāo)，nm23表達(dá)則提示乳腺癌患者預(yù)后較好，聯(lián)合檢測(cè)p53、C-erbB-2、VEGF-C和nm23有助于乳腺癌患者的治療和預(yù)后判斷。

乳腺癌;p53;C-erbB-2;VEGF-C;nm23

乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤，占女性全部惡性腫瘤的22%［1］，且發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)，其死亡率與腫瘤侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2］。目前主要采用手術(shù)、放療和化療及內(nèi)分泌治療，近年來靶向治療成為研究熱點(diǎn)。本研究采用免疫組化方法檢測(cè) p53，C-erbB-2，VEGF-C和nm23在乳腺癌中的表達(dá)及其與各臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，為乳腺癌患者預(yù)后判斷及臨床治療提供依據(jù)和新的參考指標(biāo)，也將為乳腺癌治療提供新的靶點(diǎn)和生物標(biāo)記物。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

100例經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師確診為乳腺癌的活性標(biāo)本取自大連大學(xué)附屬醫(yī)院，病人年齡中位數(shù)50歲，術(shù)前均未做任何放療、化療、內(nèi)分泌和靶向治療，診斷明確，臨床資料完整，所有患者均行乳腺癌改良根治術(shù)，分別取癌組織和癌旁正常組織及相應(yīng)淋巴結(jié)組織以備實(shí)驗(yàn)所需。按WHO乳腺癌臨床TNM分期標(biāo)準(zhǔn)［2］:Ⅰ期25例，Ⅱ期35例，Ⅲ期40例;腫瘤直徑＜2 cm者21例，≥2 cm者79例;有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分別為53例和47例。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定后，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，然后免疫組化染色。

1.2 免疫組織化學(xué)

單克隆抗體購于Cell Signaling公司，SP試劑盒與DAB顯色液購于福州邁新公司。常規(guī)SP法按試劑盒說明書進(jìn)行，一抗工作濃度為1∶50，用PBS代替一抗為陰性對(duì)照，用已知陽性切片做陽性對(duì)照。二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%雙氧水滅火內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗，微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉，一抗4℃過夜，二抗、三抗各1 h，DAB顯色7～10 min，復(fù)染核脫水透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定

光學(xué)顯微鏡下，以細(xì)胞核或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色或黃色顆粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，免疫組化結(jié)果參考下面標(biāo)準(zhǔn)判定:隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，選定1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比，無細(xì)胞核陽性信號(hào)，0分;陽性細(xì)胞數(shù)1% ～25%，1分;陽性細(xì)胞數(shù)26% ～50%，2分;陽性細(xì)胞數(shù)51% ～75%，3分;陽性細(xì)胞數(shù)＞75%，4分。按著色細(xì)胞的染色強(qiáng)度分:淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩次評(píng)分乘積為每張切片最后得分:0～1分為陰性(–)，2分為弱陽性(±)，3～4分為陽性(+)，5～6分為中度陽性(++)，6分以上為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SSPS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)包，采用χ2檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p53和C-erbB-2蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

p53蛋白表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞核，C-erbB-2蛋白表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)。p53和C-erbB-2在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)在患者年齡、腫瘤大小方面差異無顯著性意義(P＞0.05)，但在有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同臨床分期和癌分化程度方面差異均有顯著性意義(P ＜0.05)(表 1、2、5)。

表1 p53蛋白在乳腺癌組織、癌旁正常組織、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)Tab 1 The expressions of p53 protein in breast cancer tissues，adjacent normal breast tissues as well as breast cancer tissues with and without lymph node metastases

2.2 VEGF-C蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

VEGF-C陽性細(xì)胞為彌漫性細(xì)胞漿著色。其在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)在患者年齡、不同臨床分期方面差異無顯著性意義(P＞0.05)，但在有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和癌分化程度方面差異均有顯著性意義(P ＜0.05)(表3、5)。

2.3 nm23蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

nm23表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，少數(shù)為細(xì)胞膜。其在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)在患者年齡、腫瘤大小、不同臨床分期和癌分化程度方面差異無顯著性意義(P＞0.05)，但在有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異均有顯著性意義(P ＜0.05)(表4、5)。

表2 C-erbB-2蛋白在乳腺癌組織、癌旁正常組織、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)Tab 2 The expressions of C-erbB-2 protein in breast cancer tissues，adjacent normal breast tissues as well as breast cancer tissues with and without lymph node metastases

表3 VEGF-C蛋白在乳腺癌組織、癌旁正常組織、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)Tab 3 The expressions of VEGF-C in breast cancer tissues，adjacent normal breast tissues as well as breast cancer tissues with and without lymph node metastases

表4 nm23蛋白在乳腺癌組織、癌旁正常組織、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)Tab 4 The expressions of nm23 protein in breast cancer tissues，adjacent normal breast tissues as well as breast cancer tissues with and without lymph node metastases

3 討 論

乳腺癌是來自乳腺導(dǎo)管或終末導(dǎo)管小葉單元上皮的一種雌激素依賴的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是以多個(gè)原癌基因激活和抑癌基因失活為基礎(chǔ)的、多步驟、多階段的復(fù)雜過程［3］。傳統(tǒng)判斷乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)包括腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，將傳統(tǒng)預(yù)測(cè)指標(biāo)與分子預(yù)測(cè)指標(biāo)相結(jié)合預(yù)測(cè)乳腺癌患者的生存率為國內(nèi)學(xué)者所關(guān)注。

p53基因是一種重要的抑癌基因，編碼53 kDa核磷酸蛋白，分野生型(Wtp53)和突變型(Mtp5)［4］。Wtp53 含量低、半衰期短，30 ～60 min，免疫組化無法檢測(cè)其抗原成分。Mtp53在組織內(nèi)半衰期長(zhǎng)，含量高，為免疫組化檢測(cè)提供了條件。Mtp53蛋白是目前研究最多的抑癌基因之一，它不僅失去了正常的抑癌作用，而且具有促進(jìn)正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用，導(dǎo)致其它基因激活［4］。當(dāng)Mtp53蛋白在細(xì)胞內(nèi)積聚，則促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。許多研究結(jié)果顯示，p53蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)型增生、腫瘤細(xì)胞的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，浸潤(rùn)范圍越廣，分化越低的乳腺腫瘤，其p53基因水平越高，提示p53基因蛋白陽性乳腺癌患者預(yù)后不良，生存期短［5］。本研究結(jié)果顯示，p53蛋白的差異表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和癌分化程度相關(guān)，檢測(cè)p53蛋白在乳腺癌中的表達(dá)對(duì)腫瘤惡性程度、腫瘤增殖能力以及預(yù)后判斷具有重要指導(dǎo)意義和臨床價(jià)值。

表5 p53，C-erbB-2，VEGF-C和nm23蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系Tab 5 The associations of protein expression levels of p53，C-erbB-2，VEGF-C and nm23 with clinical pathology of breast cancer n(%)

C-erbB-2是生長(zhǎng)因子受體類癌基因，編碼分子量為185 kDa的跨膜糖蛋白，該蛋白具有酪氨酸激酶活性［6］。正常情況下，C-erbB-2處于非激活狀態(tài)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化調(diào)節(jié)，當(dāng)受到某些致癌因素作用后，其結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控失常，以基因擴(kuò)增的形式被激活，從而具有腫瘤轉(zhuǎn)化的活性。研究表明，細(xì)胞凋亡是由C-erbB-2分子C-末端介導(dǎo)的，其通過抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)生瘤。C-erbB-2過表達(dá)不僅是乳腺癌發(fā)生的早期事件，且在進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中也起重要作用，與腫瘤惡性程度高、生長(zhǎng)快、預(yù)后差相關(guān)，目前它已被認(rèn)為是與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因［7］。本研究結(jié)果表明，C-erbB-2陽性表達(dá)在臨床Ⅱ、Ⅲ期陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。故C-erbB-2陽性表達(dá)往往提示患者復(fù)發(fā)率高，死亡率高，預(yù)后不良，可作為判斷預(yù)后指標(biāo)。

VEGF-C是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(VEGFR-3)的配體，具有調(diào)節(jié)淋巴管生成以及脈管滲透性的作用［8］，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合后使VEGFR-3二聚體化，并激活酪氨酸激酶活性導(dǎo)致其自身磷酸化，進(jìn)而激活下游MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致淋巴管密度增高，使腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍形成新生淋巴管［9］。VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合后同時(shí)也改變了原有淋巴管免疫防御功能和原有表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附分子，使得淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子更易于與腫瘤細(xì)胞發(fā)生作用，便于腫瘤細(xì)胞從淋巴管侵入和播散，而發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移［9］。VEGF-C能夠提高血管滲漏性，造成腫瘤組織間質(zhì)液壓增大，使連接淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和周圍結(jié)締組織的開放連接增多、間隙增大，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管中轉(zhuǎn)移起到關(guān)鍵作用［9］。乳腺癌細(xì)胞中VEGF-C過表達(dá)與淋巴管生成程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度顯著相關(guān)，其表達(dá)水平與預(yù)后密切相關(guān)，VEGF-C高表達(dá)患者的無復(fù)發(fā)生存期及總生存期較短［10］。本研究結(jié)果表明VEGF-C與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用。

nm23是典型的轉(zhuǎn)移抑制基因，編碼17 kDa的核內(nèi)及胞漿蛋白，其基因產(chǎn)物NDPK參與通過影響微管聚合而調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并通過影響G蛋白的信號(hào)傳遞而發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。一般認(rèn)為nm23在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)，而與各臨床病理學(xué)的關(guān)系報(bào)道不一，大部分研究表明該基因產(chǎn)物有預(yù)后價(jià)值，nm23蛋白高表達(dá)與預(yù)后好有關(guān)，而低表達(dá)往往預(yù)后差。本研究與之報(bào)道結(jié)果一致。

p53、C-erbB-2、VEGF-C及 nm23表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)p53、C-erbB-2、VEGFC和nm23有助于乳腺癌患者的治療和預(yù)后判斷。

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Expression and clinical significance of p53，C-erbB-2，VEGF-C and nm23 in breast cancer

LIU Jian，TAO Ya-jun，CHEN Ying-jie，YANG Ru -hong
(Department of Pathology，Medical College of Dalian University，Dalian116622，China)

Abstract:［Objective］To study the expression and clinical significance of p53，C-erbB-2，VEGF-C and nm23 in breast cancer.［Methods］The expression of p53，C -erbB -2，VEGF -C and nm23 were examined in 100 cases of breast cancer and adjacent normal breast tissue without chemotherapy by using SP immunohistochemical technique.［Results］In 100 cases of breast cancer and adjacent normal breast tissue，the positive rate of p53，C-erbB-2，VEGF-C and nm23 were 86.0%and 30.0%，76.7%and 25.0%，80.0%and 20.0%，30.0%and 90.0%，respectively.There were significant difference in the positive rates of p53 and C-erbB-2 in different lymphatic metastasis，clinical stages and histological grade(P＜0.05);The expression of VEGF -C was significantly related with lymphatic metastasis，tumor sizes and histological grade(P＜0.05);It showed significant correlations of the positive rate of nm23 in lymphatic metastasis(P＜0.05).［Conclusion］The expression of p53，C -erbB -2，VEGF-C and nm23 were positively related to the metastasis and prognosis of breast cancer，the combined detection of p53，C-erbB-2，VEGF-C and nm23 is valuable to predicting prognosis and guiding therapy of breast cancer.

Key words:breast cancer;p53;C-erbB-2;VEGF-C;nm23

Q956

A

1671-7295(2012)05-0450-05

2012-05-20;

2012-09-22

劉 健(1973-)，女，遼寧大連人，講師，博士。E-mail:jianliu0607@163.com