宋 巖，劉秀萍，白偉良，季文樾

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧沈陽 110004)

黃芪對喉癌Hep-2細胞增殖和凋亡的影響

宋 巖，劉秀萍，白偉良，季文樾

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧沈陽 110004)

［目的］體外觀察黃芪對人喉鱗狀細胞癌細胞系Hep-2的抑制增殖和誘導凋亡作用并探討其作用機制。［方法］用20、100、200 μg/mL的黃芪作用于Hep-2細胞24 h，MTT法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期分布和細胞凋亡率，共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞凋亡，Western Blot檢測Bcl-2和Cyclin B1的蛋白表達。［結果］黃芪對Hep-2細胞的增殖抑制作用具有明顯的劑量依賴性;隨著黃芪濃度增高，處于G2/M期細胞的比例逐漸升高，同時伴有G0/G1期細胞減少，細胞凋亡率逐漸升高，各實驗組之間及其與對照組之間的差異均有顯著性意義(P＜0.05);熒光顯微鏡觀察可見典型細胞凋亡;Western Blot檢測顯示黃芪可劑量依賴性抑制Bcl-2和Cyclin B1的蛋白表達。［結論］黃芪可通過抑制Bcl-2和Cyclin B1的蛋白表達，引起喉癌細胞G2/M期阻滯，抑制增殖和凋亡，發(fā)揮抗癌作用。

黃芪;喉癌;凋亡

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率近年來呈增長趨勢。喉癌總的生存率很低，因此，人們一直在不斷地尋求有效的治療方式，其中之一就是尋找新的、高效、低毒的抗腫瘤藥物。近年來國內外研究表明，黃芪中黃酮成分黃芪素，通過調節(jié)花生四烯酸系統(tǒng)的代謝，誘導腫瘤細胞周期停滯，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，抗腫瘤侵襲和轉移，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性等機制發(fā)揮其抗腫瘤作用。本文探討不同濃度黃芪對人喉癌Hep-2細胞的生長抑制和誘導凋亡作用，為進一步闡明黃芪的抗喉癌機制及臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

細胞株:喉鱗狀細胞癌hep-2細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所。試劑:黃芪注射液購自正大青春寶集團，核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)，MTT，碘化丙啶(proidum iodide，PI)，二甲基亞楓(dimethyI，sulfoxide，DMSO)等均購自 Sigma公司;Annexin V凋亡檢測試劑盒購自凱基公司;CCK8和OECHST33258，CyclinB1，Bcl-2抗體購于上海生工;TMPI-1640培養(yǎng)液由Gibco生產;標準胎牛血清，胰蛋白酶，青鏈霉素，磷酸鹽緩沖溶液(phophate buffered saline，PBS)購自上海生工生物有限公司。儀器:FACSCalibur型流式細胞儀(美國，Becto Dickinson公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱、離心機(日本，SANYO公司)，SW-CJ-1B型凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)

1.2 細胞培養(yǎng)

喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，至生長到對數期用于下述實驗。

1.3 細胞增殖檢測

Hep-2細胞在含有10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，消化并計數細胞，調整細胞密度5×104/mL，以5×103/孔的密度接種細胞于96孔板，接種后第2天加入不同濃度黃芪(20，100，200 μg/mL)的培養(yǎng)液，對照組加等體積 RPMI 1640，每組3個復孔。分別于藥物作用24 h后加入CCK8 試劑10 μL，37℃反應2 h，450 nm 波長檢測各孔吸光度值(A)。

按公式計算細胞存活率:存活率=(1-實驗組A/對照組A)×100%。實驗重復3次。

1.4 流式細胞儀分析細胞凋亡率

將對數生長期Hep-2細胞按濃度1×107個/瓶接種到細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，換成含有不同濃度的黃芪(20，100，200 μg/mL)的培養(yǎng)液，繼續(xù)作用24 h，收集細胞，PBS洗2次，70%冰乙醇4℃下固定，加入RNase溶液，上機前加入PI遮光染色30 min，PBS洗2次，過100目網，調整細胞濃度到1×106個/L，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 熒光顯微鏡觀察凋亡

將預處理過的蓋玻片置于6孔板內，Hep-2細胞(5×105/孔)接種過夜，分為正常對照組與給藥組，給藥組加入200 μg/mL的黃芪培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，PBS洗2次，用吹風機(冷風)吹干玻片，固定液(甲醇與冰乙酸的體積比為3∶1)固定15 min，PBS洗1次，加Hoechst 33258熒光染料(1 mL)，37℃避光孵育20 min，含1%甘油的PBS封片，于熒光顯微鏡下觀察，照相。

1.6 Western Blot分析

將喉癌細胞分 4 組分別加(20，100，200 μg/mL)不同濃度黃芪及培養(yǎng)基作用喉癌Hep-2細胞24 h后，用預冷的PBS洗細胞2次，然后加細胞裂解液冰上放置20 min，12000 r/min，4℃離心20 min，收集上清液定量分析。取已定量的總蛋白進行12%SDS-PAGE實驗，電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入1∶500稀釋的兔抗人Bcl-2，CyclinB1 單克隆抗體，室溫孵育 3 h，TBS 洗滌后加入稀釋度1∶4000的二抗，室溫孵育90 min;TBS洗滌后經化學發(fā)光試劑孵育，發(fā)光，顯示實驗結果。所有實驗重復3遍后采用ECL檢測系統(tǒng)，應用GENE TOOLS軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有計量資料均采用±s表示，兩組之間均數的比較采用t檢驗，3組以上樣本間關系采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 黃芪對喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞生長的抑制作用

藥物作用24 h 后，20 μg/mL、100 μg/mL 與200 μg/mL黃芪組抑制率分別為(35.38±0.17)%、(59.12 ±0.21)%和(84.55 ±0.27)%，各組比較差異均有顯著性意義，P＜0.05。

2.2 黃芪對Hep-2細胞周期分布及細胞凋亡的影響

檢測結果表明，不同濃度的黃芪分別作用Hep-2細胞24 h后，與對照組比較，S期細胞比例減少，G2/M期細胞比例顯著增加，阻滯在G2/M期，且差異均有顯著性意義(P＜0.05);隨著黃芪濃度的增加，阻滯作用呈增強的趨勢，見圖1。

圖1 不同濃度黃芪作用24 h后細胞各周期分布Fig 1 Flow cytometry analysis cell cycle distribution in different concentrations of Astragalus groups

2.3 黃芪作用Hep-2細胞24 h后形態(tài)學變化

Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察，200 μg/mL黃芪作用于Hep-2細胞24 h細胞形態(tài)發(fā)生顯著性改變，呈現染色質邊集，核固縮，核片斷化，核碎裂溶解。隨著黃芪濃度增加，凋亡的細胞明顯增多，甚至出現大片細胞脫落形成細胞脫失區(qū)，結果見圖2。

2.4 不同濃度黃芪作用后Bcl-2和Cyclin B1表達情況

分別用20，100，200 μg/mL 黃芪處理細胞 24 h后，cyclin B1和Bcl-2后蛋白表達下降，隨濃度增加而明顯下降，見表1、圖3。

圖2 Hoechst33258觀察黃芪作用Hep-2細胞24 h后形態(tài)學變化Fig 2 Observe Hep-2 cell apoptosis with Astragalus treating by Hoechst 33258 staining

表1 不同濃度黃芪作用后Bcl-2和CyclinB1蛋白表達的變化Tab 1 Protein expression of Bcl-2 and Cyclin B1(±s)

表1 不同濃度黃芪作用后Bcl-2和CyclinB1蛋白表達的變化Tab 1 Protein expression of Bcl-2 and Cyclin B1(±s)

與對照組比較，1)P ＜0.01，2)P ＜0.05

Bcl-2 Cyclin B1對照組1.15 ±0.08 0.97 ±0.24黃芪 20 μg/mL 組 0.74 ±0.071) 0.64 ±0.122)黃芪 100 μg/mL 組 0.26 ±0.041) 0.43 ±0.191)黃芪 200 μg/mL 組 0.13 ±0.021) 0.15 ±0.031)

圖3 不同濃度黃芪作用后Bcl-2和Cyclin B1蛋白表達情況Fig 3 Protein Expression of Bcl-2 and Cyclin B1 with Astragalus treating by Western blot assay

3 討論

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，是東北地區(qū)最常見的頭頸部惡性腫瘤，大約占所有新發(fā)惡性腫瘤的1%，其中90%以上是喉鱗狀細胞癌。目前，在放化療和外科手術聯(lián)合治療的情況下，Tis、T1及T2期喉癌治療有效率在80%～90%左右，而T3、T4期喉癌只有40%～50%。盡管外科手術和放化療技術有了明顯進步，但患者的5年生存率仍沒有提高，原因是多方面的，其中對發(fā)病機制研究不夠完善、沒有明確的治療靶點是最關鍵的。

近年來國內外研究表明，黃芪中黃酮成分黃芪素，通過調節(jié)花生四烯酸系統(tǒng)的代謝，誘導腫瘤細胞周期停滯，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，抗腫瘤侵襲和轉移，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性等機制發(fā)揮其抗腫瘤作用。Roy等［1］發(fā)現用小劑量黃芪素(10或20 mol/L)使人白血病HL-60細胞大量停滯于S或G2/M期，而大劑量黃芪素則誘導細胞凋亡。Chao等［2］研究發(fā)現黃芪素可使膀胱癌細胞停滯于G2/M 期。Leung等［3］用50 μmol/L黃芪素培養(yǎng)人非小細胞性肺癌H460細胞24 h后，發(fā)現細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase，CDK1)和細胞周期蛋白(cyclin)B1蛋白表達明顯降低，導致S期生長停滯，阻止細胞從S期進入G2/M期。本研究發(fā)現，黃芪具有抑制喉癌Hep-2細胞生長，促進凋亡的作用。其作用機制可能和黃芪調控Bcl-2，Cyclin B1凋亡相關基因有關。

本研究通過MTT檢測發(fā)現，黃芪對喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的生長具有抑制作用，且呈現明顯的濃度依賴性。抑制率曲線隨濃度增加而逐漸上升，到200 μg/mL時，表現出強烈的抑瘤效果，由此推斷黃芪可以在體內外發(fā)揮對喉癌的抑制作用。

通過流式細胞檢測不同濃度的黃芪作用于Hep-2細胞后引起的細胞周期停頓，細胞大量停滯于G2/M期，說明黃芪可通過阻止細胞進入S期生長來誘導喉癌Hep-2細胞凋亡。

凋亡是在基因的調控下進行的，相關基因分為促凋亡基因、抑制凋亡基因和凋亡過程表達基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關，黃芪素誘導腫瘤細胞凋亡可能與影響上述基因蛋白的表達有關。凋亡抑制蛋白家族(IAP)研究顯示黃芪素誘導膀胱癌細胞生長周期停滯和凋亡的可能機制是通過CDC2-survivin通路，即黃芪素顯著降低腫瘤細胞cyclin B1的表達，CDC2磷酸化和survivin的表達，從而抑制p38-MAPK和AKT的磷酸化激活［4］。本實驗結果證實在喉癌Hep-2細胞內顯示隨著黃芪作用濃度增大cyclinB1和Bcl-2蛋白表達下降，且隨濃度增加而明顯下降。說明黃芪可通過抑制細胞周期調控基因cyclin B1和抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達起到促凋亡作用。

本研究首次證明黃芪能夠誘導Hep-2細胞發(fā)生凋亡，并有效抑制Hep-2細胞的活性。黃芪對Hep-2細胞的抑制作用在一定范圍內呈濃度依賴性。黃芪可以通過調節(jié)cyclin B1和Bcl-2來抑制喉癌Hep-2細胞增殖并誘導其凋亡，在未來喉癌的治療中，黃芪有著廣闊的應用前景。

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［1］Roy MK，Nakahara K，Na TV，et al.Baicalein，a flavonoid extracted from a methanolic extract of Oroxylum indicum inhibits proliferation of a cancer cell line in vitro via induction of apoptosis［J］.Pharmazie，2007，62(2):149 -153.

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Effects of astragalus on cell proliferation and apoptosis in Hep-2 cells in vitro

SONG Yan，LIU Xiu-ping，BAI Wei-liang，JI Wen-yue
(Department of Otolaryngology，Sheng-Jing Hospital，China Medical University，Shenyang110004，China)

Abstract:［Objective］To investigate the mechanism underlying the anticancer activity of Astragalus on human laryngeal cancer.［Method］Hep -2 cells were treated with astragalus in different concentrations for 24 h.MTT assay was used to evaluate cell proliferation.Flow cytometry with PI staining and fluorescent microscopy with Hoechst 33258 staining were used to estimate cell cycle distribution and apoptosis.Expressions of Bcl-2 and Cyclin B1 were evaluated by western blot.［Result］Astragalus inhibited cellular proliferation in a dose dependent manner(P＜ 0.05).Flowcytometry analysis showed that treatment with astragalus resulted in accumulation cells at the G2/M phase of the cell cycle and cell apoptosis in a dose dependent manner(P＜0.05).Marked morphological changes of cell apoptosis including condensation of chromatin，nuclear fragmentation and apoptotic bodies were observed clearly by Hoechst 33258 staining.Western blot analysis demonstrated that the expressions of Bcl-2 and Cyclin B1 were suppressed significantly.［Conclusion］Astragalus inhibited Hep-2 cells proliferation and induced them apoptosis by down regulating the expressions of Bcl-2 and Cyclin B1.

Key words:astragalus;laryngeal carcinoma;apoptosis

R735.7

A

1671-7295(2012)05-0432-04

遼寧省自然科學基金(20082105)

2012-06-04;

2012-09-03

宋 巖(1982-)，女，遼寧沈陽人，博士。E-mail:songy1@sj-hospital.org

季文樾，主任醫(yī)師。E-mail:jiwy@sj-hospital.org