馮彩麗 于 泳 蔣立新 張洪山

1.北京舒泰神新藥研究有限公司，北京 100176；2.北京賽升藥業(yè)股份有限公司，北京100176

高純度的鬼臼毒素治療生殖器疣療效顯著，且無系統(tǒng)性毒副作用。作為目前治療尖銳濕疣的一線藥物，鬼臼毒素酊劑在臨床已應(yīng)用多年，其治療作用得到廣泛的肯定。酊劑在使用過程中會對皮膚產(chǎn)生較大的刺激性，應(yīng)用后局部皮膚黏膜糜爛，給患者造成較大的痛苦。為提高患者的依從性，臨床使用時會聯(lián)合局麻藥，比如鹽酸利多卡因等，以減少鬼臼毒素的刺激性，從而增加患者的依從性。本公司通過摸索應(yīng)用現(xiàn)代制劑技術(shù)將鬼臼毒素和鹽酸利多卡因兩個藥物進行組合研制出復(fù)方鬼臼毒素凝膠劑，該劑型比現(xiàn)有的酊劑、膏劑、激光治療有明顯應(yīng)用優(yōu)勢，大大提高了患者的依從性。以往文獻中均報道鬼臼毒素的各種含量測定方法，但無有關(guān)物質(zhì)方面的研究，實際鬼臼毒素受pH影響，易被氧化，本制劑中除含有凝膠劑的常用輔料，還含有鹽酸利多卡因局麻藥，為考察本復(fù)方中鬼臼毒素是否穩(wěn)定，并且不受鹽酸利多卡因的干擾，筆者通過摸索建立了鬼臼毒素的有關(guān)物質(zhì)測定方法，從而更好地評價含鬼臼毒素的各種制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津：型號LC-20AT，LC-solution工作站，SPD-20A檢測器，CBM-20A控制器），CX-250 型超聲波清洗器（北京市醫(yī)療設(shè)備二廠）。

復(fù)方鬼臼毒素凝膠（北京舒泰神新藥研究有限公司，批號：20100111、20100114、20100118），鬼臼毒素原料藥（福建華海藥業(yè)有限公司，批號：091201），鹽酸利多卡因原料藥（山西新寶源制藥有限公司，批號：20070501），鬼臼毒素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111645-200301），甲醇（Burdick&Jackson，色譜純），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

2.1.1 色譜柱

Kromasil ODS 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以磷酸鹽溶液（取磷酸氫二鉀17.12 g，置1 000 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用稀磷酸調(diào) pH 值至 7.5）-甲醇（48∶52）為流動相；檢測波長為292 nm；柱溫為30℃。理論塔板數(shù)按鬼臼毒素峰計算應(yīng)不少于5 000。

2.1.2 測定方法

取本品3 g（約相當(dāng)于鬼臼毒素15 mg，鹽酸利多卡因60 mg），置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，強力振搖，使凝膠溶解，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液即為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液Ⅰ。另取不含鬼臼毒素的凝膠空白輔料同法配制，作為空白輔料溶液。精密量取對照溶液20 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主峰峰高約為滿量程的20%。再精密量取空白輔料溶液及供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的4 倍，供試品溶液若顯雜質(zhì)峰，扣除空白輔料溶液色譜峰后，量取各雜質(zhì)峰的峰面積總和，應(yīng)不大于對照溶液主峰面積的2 倍。

2.2 方法驗證過程

2.2.1 專屬性試驗研究

為使方法具有很好的專屬性，分別進行了如下試驗研究：2.2.1.1 復(fù)方鬼臼毒素凝膠（不加鹽酸利多卡因）樣品的破壞試驗 凝膠樣品（不加鹽酸利多卡因）溶液：取本品3 g（約相當(dāng)于鬼臼毒素15 mg），置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，強力振搖，使凝膠溶解，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為凝膠樣品溶液A。分別取凝膠樣品溶液A適量進行酸、堿、氧、高溫、光照的破壞試驗，分別取各破壞樣品過濾后，精密量取20 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，由圖1 可知，不加鹽酸利多卡因的凝膠破壞色譜圖中，各色譜峰均在50 min之前出峰，各峰分離度符合要求。

2.2.1.2 復(fù)方鬼臼毒素凝膠（不加鬼臼毒素）樣品的破壞試驗取凝膠（不加鬼臼毒素）樣品3 g（約相當(dāng)于鹽酸利多卡因60 mg），置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，強力振搖，使凝膠溶解，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為凝膠樣品溶液B。分別取凝膠樣品溶液B適量進行酸、堿、氧、高溫、光照的破壞試驗，分別取各破壞樣品過濾后，精密量取20 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，由圖2 可知，不加鬼臼毒素的凝膠破壞色譜圖中，扣除溶劑峰后，只在50 min之后出現(xiàn)一個色譜峰，即鹽酸利多卡因的色譜峰，由于出峰時間比較長，所以保留時間有波動，但不干擾鬼臼毒素各峰的檢驗。

2.2.1.3 復(fù)方鬼臼毒素凝膠樣品的破壞試驗 取凝膠樣品3 g（約相當(dāng)于鬼臼毒素15 mg，鹽酸利多卡因60 mg），置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，強力振搖，使凝膠溶解，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液即為供試品溶液。分別取供試品溶液適量進行酸、堿、氧、高溫、光照的破壞試驗，分別取上述溶液樣品過濾后，精密量取20 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，由圖3 可知，50 min之前出現(xiàn)的色譜峰與不加鹽酸利多卡因的凝膠破壞色譜圖中出現(xiàn)的色譜峰基本一致，即均為鬼臼毒素產(chǎn)生，而在50 min之后出現(xiàn)的色譜峰，均與不加鬼臼毒素的凝膠（只含鹽酸利多卡因）破壞色譜圖中出現(xiàn)的色譜峰一致，即扣除50 min之后色譜峰后，即為鬼臼毒素產(chǎn)生的色譜峰，不干擾鬼臼毒素各峰的檢驗。

2.2.2 檢測限

取鬼臼毒素對照品適量，精密稱定，用甲醇-水=40∶60（pH=4.0）溶解稀釋制成濃度為0.061 μg/mL的溶液，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，此時主峰峰高約為基線噪音的3 倍，即檢測限（S/N=3）為 0.61 ng。

2.2.3 精密度試驗

取鬼臼毒素對照品適量，精密稱定，用甲醇-水=40∶60（pH 4.0）溶解稀釋制成濃度為0.3 mg/mL的溶液，連續(xù)進樣6次，主峰峰面積的RSD為0.27%，符合要求。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取凝膠樣品3 g，按“2.1”項下方法，制備供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8 h測定，記錄色譜圖中鬼臼毒素的雜質(zhì)峰面積，提示溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表1。

2.2.5 重復(fù)性試驗

取凝膠樣品，照“2.1”項下測定方法平行配制6份供試品溶液并測定有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果6份樣品的有關(guān)物質(zhì)平均值為0.20%，RSD符合要求。

表1 溶液穩(wěn)定性試驗中峰面積的測定結(jié)果（UV法）

2.3 三批樣品有關(guān)物質(zhì)測定

取復(fù)方鬼臼毒素凝膠樣品（批號：20100111、20100114、20100118）及空白輔料適量，精密稱定，按“2.1”項下方法測定，三批樣品的有關(guān)物質(zhì)分別為0.21%、0.23%、0.25%。

所有檢測均在儀器通道A（Channel A）下進行。

3 討論

3.1 流動相的選擇

[1-3]并根據(jù)大量預(yù)實驗液相條件摸索結(jié)果可知，在甲醇-0.1 mol/L磷酸氫二鉀（pH=7.5）系統(tǒng)中，鬼臼毒素保留時間適中，峰形較好，對該流動相系統(tǒng)進一步考察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇-0.075 mol/L磷酸氫二鉀（調(diào)pH=7.5）為48∶52 時可獲得最優(yōu)峰形，且雜質(zhì)與主峰分離良好，因此確定流動相為：磷酸鹽溶液（取磷酸氫二鉀17.12 g，置1 000 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用稀磷酸調(diào) pH 值至 7.5）－甲醇（48∶52）。在流動相摸索過程中，發(fā)現(xiàn)柱溫對本品的的鬼臼毒素及鹽酸利多卡因保留時間有影響，因此控制本品的柱溫為30℃

3.2 溶解樣品溶劑的選擇

由于鬼臼毒素在pH值高的環(huán)境下不穩(wěn)定，且鬼臼毒素幾乎不溶于水，而略溶于甲醇及無水乙醇；鹽酸利多卡因易溶于水及無水乙醇。所以應(yīng)選擇pH值低的、并含有一定比例的有機溶劑來溶解鬼臼毒素原料，通過試驗可知，在甲醇-水=40∶60（pH=2.0～4.0）的溶劑中，鬼臼毒素穩(wěn)定，但低 pH值下，損傷色譜柱，因此選擇甲醇-水=40∶60（pH=4.0）作為溶劑來溶解鬼臼毒素及鹽酸利多卡因原料。

凝膠樣品的輔料中含有增溶劑及水溶性高分子物質(zhì)，并且 pH 值（3.0～5.0）較低。曾采用甲醇-水=40∶60（pH=4.0）的溶劑來溶解樣品，結(jié)果過濾困難，所以考慮直接用水稀釋樣品，具體方法為取凝膠樣品3 g，置50 mL量瓶中，加水適量，振搖使凝膠溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液備用。試驗結(jié)果表明，采用水來溶解樣品，易于過濾，并且樣品溶液的穩(wěn)定性符合要求。

3.3 測定波長的選擇

稱取鬼臼毒素對照品適量，用甲醇-水=40∶60（pH=4.0）的溶劑配制成每毫升約含50 μg的溶液，作為供試品溶液，取供試品溶液適量，照紫外分光光度法在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示，鬼臼毒素在292 nm、216 nm波長處有最大吸收。另取原料、輔料及專屬性項下破壞的樣品，采用液相色譜法分別在220 nm（因216 nm波長太低，基線不平穩(wěn)）、292 nm下檢測，結(jié)果顯示，在292 nm波長處檢出的雜質(zhì)峰個數(shù)及響應(yīng)值均比220 nm波長處檢出的多，但在292 nm波長處檢出的輔料峰更少，因此，為減少輔料干擾以及近紫外區(qū)易造成的基線漂移和噪聲干擾，同時參考國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-043）-2002Z鬼臼毒素項下有關(guān)物質(zhì)的檢測波長為292 nm，因此本品選擇292 nm作為有關(guān)物質(zhì)檢查的測定波長。

3.4 有關(guān)物質(zhì)研究

圖1 不加鹽酸利多卡因凝膠樣品及破壞的色譜圖

圖2 不加鬼臼毒素的凝膠樣品及各種破壞的色譜圖

本品為復(fù)方制劑，對復(fù)方制劑的有關(guān)物質(zhì)研究的文獻報道較少，一般由于主藥成分性質(zhì)的差異，很難采用一個色譜條件將主成分各雜質(zhì)峰及降解產(chǎn)物峰分開，本實驗中曾摸索采用同一個色譜條件分析鬼臼毒素與鹽酸利多卡因有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果或是雜質(zhì)與主峰的分離度達不到要求，或是兩個主峰的雜質(zhì)峰之間相互干擾，降解產(chǎn)物峰分不開，或是保留時間太長。所以考慮采用兩種液相條件分別對鬼臼毒素及鹽酸利多卡因進行有關(guān)物質(zhì)考察，本文對鬼臼毒素的有關(guān)物質(zhì)進行了詳細研究，從專屬性研究結(jié)果可知，采用本色譜條件，空白輔料及鹽酸利多卡因不干擾鬼臼毒素有關(guān)物質(zhì)的檢測，破壞條件下產(chǎn)生的色譜峰均為鬼臼毒素產(chǎn)生的色譜峰，與主峰的分離度符合要求。

圖3 凝膠樣品及各種破壞的色譜圖

綜上所述，采用HPLC測定復(fù)方鬼臼毒素凝膠中鬼臼毒素的有關(guān)物質(zhì)，專屬性好，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可用于本品的質(zhì)量控制，同時本研究也為復(fù)方制劑的有關(guān)物質(zhì)研究提供了一種研究思路。

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