冀云肖，常 蕓

一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心肌核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B的變化及其在運(yùn)動(dòng)性心肌微損傷發(fā)生中的作用

冀云肖，常 蕓

目的：研究一次性力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌NF-κ B在基因與蛋白水平的分布及變化規(guī)律。方法：100只健康成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)組及安靜對(duì)照組。應(yīng)用RT-PCR和免疫熒光組化技術(shù)，從mRNA及蛋白水平研究大鼠心肌NF-κ Bp65的在力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相的分布及表達(dá)變化。結(jié)果：對(duì)照組NF-κ B主要分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜及血管內(nèi)膜，偶見(jiàn)于細(xì)胞核內(nèi)，力竭運(yùn)動(dòng)后NF-κ B主要分布于細(xì)胞核、細(xì)胞膜和血管內(nèi)膜。一次性力竭后6 h左心室NF-κ B p65蛋白含量顯著高于對(duì)照組、12 h組、24 h組（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)后即刻室間隔NF-κ B p65蛋白含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），非常顯著高于12 h組、24 h（P＜0.01），運(yùn)動(dòng)后6 h非常顯著高于12 h組（P＜0.01）；運(yùn)動(dòng)后即刻右心室NF-κ Bp65蛋白含量即顯著高于安靜對(duì)照組、24 h組（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)后6 h組顯著高于安靜對(duì)照組（P＜0.05）。一次性力竭運(yùn)動(dòng)后即刻心肌總的NF-κ Bp65蛋白含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），6 h組非常顯著地高于對(duì)照組水平（P＜0.01），運(yùn)動(dòng)后12 h組顯著低于即刻組和6 h組。一次性力竭即刻N(yùn)F-κ Bp65mRNA含量顯著高于一次性力竭24 h組（P＜0.05）；6 h顯著高于對(duì)照組、24 h組（P＜0.05）；12 h顯著高于24 h組（P＜0.05）。結(jié)論：一次力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相心肌NF-κ BmRNA和蛋白表達(dá)增加，可介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成損傷,構(gòu)成運(yùn)動(dòng)性心肌微損傷中發(fā)生機(jī)制之一。一次力竭運(yùn)動(dòng)后心臟各部位改變存有一定差異，其中室間隔及右心室NF-κ B蛋白含量升高速度快,以室間隔NF-κ B蛋白峰值水平最高,且右心室NF-κ B蛋白改變恢復(fù)最慢。

力竭運(yùn)動(dòng)；核轉(zhuǎn)錄因子KappaB(NF-κ B)；心肌微損傷

研究表明，運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激因素對(duì)人體有明顯的的作用，適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)可以有效地改善心血管功能，使心臟產(chǎn)生一系列有益的適應(yīng)性變化。而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)特別是劇烈運(yùn)動(dòng)或力竭運(yùn)動(dòng)可造成心肌多方面的損害。運(yùn)動(dòng)性心肌微損傷及對(duì)人體的影響逐漸成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，發(fā)生機(jī)制目前尚不完全清楚，其發(fā)生過(guò)程十分復(fù)雜，涉及心肌缺氧、心血管痙攣、氧自由基、血液黏度增加、MCP-1、低氧誘導(dǎo)因子等眾多因素。

核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（nuclear factor-kappa B, NF-κ B）是一種對(duì)缺氧敏感的炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，NF-κ B可與某些基因啟動(dòng)子（promotor）固定核苷酸序列結(jié)合從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。NF-κ B可調(diào)控細(xì)胞粘附分子（如ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等）、細(xì)胞因子（IL-3、I L-6、TNF-α、IL-8等）、化學(xué)趨化因子（MCP-1等）、生長(zhǎng)因子等多種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種生物進(jìn)程[1]。研究已經(jīng)證實(shí)NF-κ B在缺血再灌注心肌損傷中起著關(guān)鍵作用，在運(yùn)動(dòng)條件下心肌細(xì)胞中NF-κ B的改變還未見(jiàn)研究報(bào)道。本文通過(guò)檢測(cè)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后心肌核轉(zhuǎn)錄因子κ B的分布和變化來(lái)探討其在力竭運(yùn)動(dòng)所致的心肌微損傷中的作用，并為醫(yī)務(wù)監(jiān)督提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康純種雄性SD大鼠100只(維通利華公司)，2月齡，體重（240±20） g，隨機(jī)分為一次性力竭運(yùn)動(dòng)即刻組、6 h組、12 h組、24 h組及一次性力竭運(yùn)動(dòng)的安靜對(duì)照組，每組10只。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（18±2）℃，光照12 h，相對(duì)濕度為40%～55%。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

依據(jù)經(jīng)典的Thomas實(shí)驗(yàn)方案建立動(dòng)物力竭運(yùn)動(dòng)致心肌微損傷模型。模型采用PVC特制泳池，規(guī)格為1.6 m×0.8 m× 1.2 m，內(nèi)壁光滑，水深約60 cm，超過(guò)大鼠身長(zhǎng)2倍，控制水溫在30～33℃。運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)入動(dòng)物房后首先適應(yīng)3 d，然后進(jìn)行2d適應(yīng)性游泳運(yùn)動(dòng)。力竭標(biāo)準(zhǔn)參照Thomas DP的報(bào)道[2]，即“大鼠連續(xù)沉入水中超過(guò)10 s，撈出后置于平面不能完成翻正反射”。

1.3 取材與樣本制備

一次性力竭運(yùn)動(dòng)組分別于運(yùn)動(dòng)后即刻、6 h、12 h、24 h取材，安靜對(duì)照組同期取材。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(1 ml/100 g體重)麻醉后，開(kāi)胸后迅速取出心臟，經(jīng)滅菌生理鹽水清洗后，濾紙吸干并稱重，然后尖銳刀片分離心室與心房，取一部分心室滴加OCT包埋劑后置于液氮冷凍20 s，以冠狀面制作冰凍切片，切取7～8 μ m厚的冰凍切片置于-70℃超低溫冰箱備用；另一部分迅速投入液氮中，后轉(zhuǎn)入-70℃超低溫冰箱待用。

1.4 心肌冰凍切片的免疫熒光染色

1.4.1 免疫熒光染色步驟

采用免疫熒光雙標(biāo)染色方法檢測(cè)心肌中NF-κ B的分布及含量。主要試劑：兔抗大鼠NF-κ B p65多克隆抗體美國(guó)Santa Cruze公司產(chǎn)品；Dyl i ght標(biāo)記山羊抗兔二抗美國(guó)Jackson公司產(chǎn)品；DAPI細(xì)胞核染液購(gòu)于碧云天生物研究所；山羊血清購(gòu)自北京中杉金橋公司。具體步驟如下：（1）從-70℃超低溫冰箱取出保存的冰凍切片，室溫復(fù)溫30 min。（2）4℃丙酮固定10 min，PBS漂洗5 min×3次；（3）滴加1：10稀釋的山羊血清，室溫封閉15 min；（4）傾去血清，勿洗，滴加1：5 0稀釋的兔抗大鼠NF-κ B p65多克隆抗體，4℃過(guò)夜；（5）取出玻片，傾去一抗，PBS漂洗5 min×3次滴加。（6）滴加1：100稀釋的Dylight標(biāo)記山羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h后PBS漂洗5 min×3次；(（7）滴加DAPI原液50 μ l/片，室溫孵育6 min，PBS洗5 min×3次。（8）甘油封片。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4.2 免疫熒光圖像采集與分析

用Leica As MDW多維活細(xì)胞成像工作站采集熒光圖，490 nm激發(fā)FITC，390 nm激發(fā)DAPI，圖像放大200倍觀察并采集熒光圖像。每張切片左心室、室間隔、右心室3個(gè)部位各隨機(jī)選取縱切心肌纖維3張圖，橫切3張圖，每張切片取18張圖。用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)對(duì)其熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量，熒光強(qiáng)度用積分灰度代表，參考陰性對(duì)照標(biāo)本中熒光強(qiáng)度，灰度值在4O～13O之間為蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 心肌RT-PC試驗(yàn)

1.5.1 心肌總R NA提取

采用硅基質(zhì)吸附法提取心肌總R N A，按照天根生化RNAsimple提取試劑盒說(shuō)明操作。取5 μ l總RNA加入95 μ l去DEPC水，在分光光度計(jì)上分別測(cè)定在260 nm和280 nm處的吸光度，計(jì)算A260/280的比值，以鑒定RNA的質(zhì)量。

1.5.2 反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)天根生化公司Quant Reverse Transcription第一鏈合成試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作建立反轉(zhuǎn)錄體系。操作步驟：將隨機(jī)引物、10xRT緩沖液、dNTP混合液、RNA free ddH2O2在室溫下解凍后迅速置于冰上，簡(jiǎn)短渦旋后簡(jiǎn)短離心收集殘留在管壁的液體，配制20 μ l逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系簡(jiǎn)短渦旋離心，37℃孵育60 min。

1.5.3 PC R擴(kuò)增內(nèi)參和目的條帶

NF-κ B p65引物（150bp）：

上游：5`-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3`

下游：5`-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3`

GAPDH引物（284bp）：

上游：5`-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT -3`

下游：5`-TCTGAGTGGCAGTGATGG-3`

在PCR薄壁管中建立20 μ l擴(kuò)增反應(yīng)體系：Tap Master Mix 10 μ l，NF-κ B p65上下游引物各0.5 μ l，內(nèi)參上下游引物各0.5 μ l，cDNA 1 μ l，ddH2O2 8 μ l總體積為20 μ l。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min；94℃變性45 s，62℃退火45 s，72℃延伸45 s，10個(gè)循環(huán)，然后94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，20個(gè)循環(huán)；末次延伸72℃ 10 min。

取7 μ l產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。用Bio-rad凝膠成像儀拍攝電泳結(jié)果，并對(duì)內(nèi)參照和目的基因條帶做光密度掃描，通過(guò)二者的灰度比值來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS15.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其中P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 一次力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心臟各部位NF-κ B p65蛋白表達(dá)與分布變化

2.1.1 一次力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心臟NF-κB p65分布變化

如圖1可見(jiàn)Dylight標(biāo)記的NF-κ B p65蛋白呈綠色點(diǎn)狀或條索狀熒光，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核呈點(diǎn)狀藍(lán)色熒光。正常對(duì)照組大鼠心肌NF-κ B p65蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞膜、血管內(nèi)膜亦有表達(dá)，偶見(jiàn)于細(xì)胞核內(nèi)（圖A）。一次力竭運(yùn)動(dòng)組后熒光斑的數(shù)量、面積和亮度與對(duì)照組相比均發(fā)生不同程度的變化，蛋白分布也發(fā)生了相應(yīng)的變化（圖B）。一次性力竭運(yùn)動(dòng)后NF-κ B p65蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞膜及血管內(nèi)膜熒光斑數(shù)量也增多，亮度增強(qiáng)。

2.1.2 一次力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心臟各部位NF-κB p65蛋白表達(dá)變化（見(jiàn)表1）

一次力竭運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠左心室肌NF-κ B p65蛋白含量上升，至運(yùn)動(dòng)后6 h達(dá)到峰值，顯著高于安靜對(duì)照（P＜0.05），隨后NF-κ B p65蛋白含量下降，至運(yùn)動(dòng)后12 h、24 h NF-κ B p65蛋白含量已降至略低于對(duì)照組水平，顯著低于運(yùn)動(dòng)后6 h（P＜0.05）。

一次力竭運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠室間隔肌NF-κ B p65蛋白含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)后6 h略有下降，至運(yùn)動(dòng)后12 h NF-κ B p65蛋白含量降至比對(duì)照組更低的水平，與運(yùn)動(dòng)后即刻、6 h組比具有非常顯著性差異（P＜0.01）；運(yùn)動(dòng)后24 h NF-κ B p65蛋白含量略有回升，顯著低于即刻組（P＜0.0 5）。

一次性力竭運(yùn)動(dòng)后即刻右心室NF-κ B p65顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)后6 h有所下降，仍顯著高于安靜對(duì)照組（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)后12 h hNF-κ B p65蛋白含量繼續(xù)下降；至運(yùn)動(dòng)后24 hNF-κ B p65蛋白含量降至略高于安靜對(duì)照組的水平，顯著低于運(yùn)動(dòng)后即刻組（P＜0.05）。2.2 一次力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心臟總NF-κ B p65mRNA及蛋白的表達(dá)變化

圖2、表2顯示，一次性力竭即刻組NF-κ B p65mRNA含量顯著高于一次性力竭24 h組（P＜0.05）。一次性力竭6 h組NF-κ B p65mRNA含量顯著高于對(duì)照組、24 h組（P＜0.05）。一次性力竭12 h組顯著高于一次性力竭24 h組（P＜0.0 5）。

如表2顯示，一次性力竭運(yùn)動(dòng)后即刻心肌總的NF-κ B p65蛋白顯著高于安靜對(duì)照組（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)后6 hNF-κ B p65蛋白非常顯著地高于對(duì)照組水平（P＜0.01），運(yùn)動(dòng)后12 h時(shí)NF-κ B p65含量顯著低于即刻組和6 h組。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和急性力竭運(yùn)動(dòng)可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響，常導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性疲勞與損傷的發(fā)生，尤其是運(yùn)動(dòng)性心肌微損傷[3-5]。運(yùn)動(dòng)性心肌微損傷表現(xiàn)為心肌結(jié)構(gòu)和功能的雙重?fù)p傷。大鼠力竭運(yùn)動(dòng)所致的心肌損傷與臨床缺血再灌注損傷存在較高的相似性，在力竭運(yùn)動(dòng)中由于心肌缺血可致心肌產(chǎn)生一定的損傷，而在運(yùn)動(dòng)后由于血液供應(yīng)的恢復(fù)，可致心肌產(chǎn)生比運(yùn)動(dòng)時(shí)更嚴(yán)重的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)所致的心肌損傷不僅發(fā)生在運(yùn)動(dòng)后即刻，而且在運(yùn)動(dòng)后3～24 h更為嚴(yán)重，即存在逐漸加重的特點(diǎn)[3]。還有研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)引起的心肌損傷在6 h的時(shí)相較嚴(yán)重，24 h后有所減輕，這些特點(diǎn)與臨床上的缺血再灌注損傷具有高度相似性[6]。因此我們稱之為運(yùn)動(dòng)性缺血再灌注損傷[7]。因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)性缺血再灌注損傷主要發(fā)生在運(yùn)動(dòng)后24 h以內(nèi)，因此我們選用0、6 h、12 h、24 h幾個(gè)時(shí)相點(diǎn)研究NF-κ B在心肌微損傷中的作用。

表1 一次力竭運(yùn)動(dòng)后各時(shí)相大鼠左心室、室間隔、右心室積分灰度值TableⅠ Integral Grey Values of Rat Left Ventricle, Ventricular Septum and Right Ventricle at the Different Phases after One-time Exhaustive Exercise

表2 一次力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心臟總的NF-κ B p65mRNA及蛋白的表達(dá)變化TableⅡ Changes of the Total NF-κ B p65mRNA and Protein Expression of Rat Heart after One-time Exhaustive Exercise

NF-κ B p可與某些基因啟動(dòng)子（promotor）固定核苷酸序列結(jié)合從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。NF-κ B可調(diào)控細(xì)胞粘附分子（如ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等)、細(xì)胞因子（IL-3、IL-6、TNF-α、IL-8等）、化學(xué)趨化因子（MCP-1等）、生長(zhǎng)因子等多種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種生物進(jìn)程[1]。在靜息細(xì)胞，NF-κ B與其抑制性蛋白I κ B結(jié)合，形成三聚體復(fù)合物以非激活的形式存在于胞漿中。在受到刺激后，I κ B降解，NF-κ B被釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的κ B結(jié)構(gòu)域，使靶基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。體內(nèi)NF-κ B的調(diào)控包括：（1）正反饋：NF-κ B活化可增強(qiáng)TNF-α、IL-1 β等的表達(dá)，這些物質(zhì)可再次激活NF-κ B，使炎癥信號(hào)放大。（2）負(fù)反饋途徑：NF-κ B的抑制蛋白也受其調(diào)控，NF-κ B活化后，其抑制蛋白的基因轉(zhuǎn)錄亦被上調(diào)，抑制蛋白增多可避免NF-κ B激活效應(yīng)無(wú)限放大，終止炎癥介質(zhì)的生成。

本研究發(fā)現(xiàn)大鼠一次性力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌NF-κ BmRNA及蛋白含量均表現(xiàn)為先上升后下降的走勢(shì)，與運(yùn)動(dòng)性缺血再灌注損傷規(guī)律相一致。研究證實(shí)，機(jī)械刺激、缺氧、自由基、細(xì)胞因子等均可激活NF-κ B，但是自由基是NF-κ B最強(qiáng)的激活因素，細(xì)胞內(nèi)自由基水平調(diào)控著NF-κ B的激活[8]。Prosenjit Sen等證明氧化應(yīng)激使NF-κ B的轉(zhuǎn)錄明顯增加[9]。大鼠力竭運(yùn)動(dòng)自由基含量升高，自由基清除酶活性降低[10,3]。大量生成的自由基包括非脂質(zhì)氧自由基和脂質(zhì)氧自由基，如超氧陰離子、羥自由基、過(guò)氧化氫等使NF-κ B在缺血階段激活的基礎(chǔ)上被進(jìn)一步激活，使NF-κ BmRNA及蛋白含量均呈上升趨勢(shì)，隨后由于負(fù)反饋逐漸增強(qiáng)，對(duì)NF-κ B抑制增強(qiáng)，使NF-κ BmRNA及蛋白均下降。NF-κ B含量升高，調(diào)控粘附分子（P-，E-，L-選擇素等）、細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1等）含量升高，中性粒細(xì)胞在粘附分子的協(xié)助下可發(fā)生遷移粘附，并可釋放自由基及2 0多種蛋白水解酶，產(chǎn)生廣泛的損傷作用，同時(shí)粘附的中性粒細(xì)胞變形能力變差，造成毛細(xì)血管的機(jī)械阻塞，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，產(chǎn)生無(wú)復(fù)流現(xiàn)象，致使細(xì)胞發(fā)生不可逆性損傷和壞死，即再灌流性心肌損傷[11]。除中性粒細(xì)胞造成的損傷外，產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子亦可分別或聯(lián)合產(chǎn)生損傷作用，如：TNF-α可以通過(guò)多種途徑影響心肌功能并造成心肌損傷,如抑制心肌收縮功能、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、刺激線粒體產(chǎn)生活性氧、促使PMN的粘附、浸潤(rùn)、活化；復(fù)血后中性粒細(xì)胞的心肌浸潤(rùn)顯著增加，與TNF-α之間有良好的正相關(guān)性，抑制TNF-α可減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減輕心肌損傷[12]；IL-1 β的大量表達(dá)亦可表現(xiàn)除細(xì)胞毒性。NF-κ B還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡對(duì)細(xì)胞造成損傷。NF-κ B可調(diào)控bcl-2、Fas、cmyc、p53、HSP和Caspase等，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡功能的蛋白家族酶類的表達(dá)[13]，使促凋亡酶與抗凋亡酶的平衡向促凋亡方向發(fā)展，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。常蕓等在研究中發(fā)現(xiàn)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后心肌凋亡明顯增加，促凋亡基因表達(dá)增多[5]。運(yùn)動(dòng)后復(fù)氧階段大量產(chǎn)生的自由基，也可以直接對(duì)細(xì)胞造成損傷。自由基可攻擊細(xì)胞脂質(zhì)膜，造成細(xì)胞膜和線粒體膜功能障礙，細(xì)胞內(nèi)鈉鈣離子失調(diào)，造成線粒體鈣超載，能量生成受阻，細(xì)胞腫脹，膜電位不穩(wěn)，心率失常；自由基還可直接攻擊核酸，引起DNA斷裂、染色體畸變，激活血小板環(huán)化酶，生成大量血栓素A2、促進(jìn)組織因子生成釋放等從而導(dǎo)致心肌頓抑、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、心肌能量代謝障礙甚至引起肌原纖維破壞、線粒體損傷等超微結(jié)構(gòu)的改變。這些損傷性改變可進(jìn)一步刺激損傷性因素的增加，對(duì)心肌產(chǎn)生顯著的損傷作用。在臨床缺血再灌注研究中有較多的試驗(yàn)證實(shí)，抑制NF-κ B可減少缺血再灌注后細(xì)胞因子、粘附分子的表達(dá)，中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)等損傷性因素的出現(xiàn)，減輕心肌損傷程度。

對(duì)大鼠心肌不同部位NF-κ B蛋白含量的比較發(fā)現(xiàn)，大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后室間隔及右心室NF-κ B蛋白含量升高速度快，室間隔NF-κ B蛋白峰值水平最高，右心室NF-κ B蛋白消退最慢，但不同時(shí)相各部位無(wú)顯著性差異。推測(cè)室間隔及右心室較左心室易受損，這一推測(cè)與以往研究一致[14]。

4 結(jié)論

4.1 一次力竭運(yùn)動(dòng)后心肌NF-κ BmRNA和蛋白表達(dá)增加，可介導(dǎo)的一系列炎癥反應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成損傷是構(gòu)成運(yùn)動(dòng)性心肌微損傷中發(fā)生機(jī)制之一。

4.2 一次力竭運(yùn)動(dòng)后心臟各部位改變存有一定差異，其中室間隔及右心室NF-κ B蛋白含量升高速度快，以室間隔NF-κ B蛋白峰值水平最高，且右心室NF-κ B蛋白改變恢復(fù)最慢。

[1]金山,戴朝六,韓喜春. NF-kB在大鼠肝缺血再灌注損傷中的活化及意義[J].實(shí)用肝臟病雜志，2006,9(1):19-21

[2]Thomas DP. (1988). Effect of repeated exhaustive exercise on myocardial sub cellular membrane structures￡?Int J Sports Med, 9(4):257-260.

[3]趙敬國(guó)，王福文.力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變觀察[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2001，20(3)：316-317

[4]趙敬國(guó)，王福文,李杰.力竭性運(yùn)動(dòng)致運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的產(chǎn)生機(jī)制[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2005,9(8):144-146

[5]常 蕓．運(yùn)動(dòng)心臟的理論與實(shí)踐[M]．北京：人民體育出版社，2 0 0 8：

[6]王東輝，熊若虹，鄭兵，等．大鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相心肌和血清SOD、GSH～Px、M DA和Ca2 的變化[J]．沈陽(yáng)體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，23(3)：332

[7]王瑩，常蕓.力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌核呼吸因子1的變化[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2008,27(4):458-460

[8]Richard C. Ho, Michael F. Hirshman, Yangfeng Li et a1. (2005). Regula-tion of I κ B kinase and NF-κ B in contracting adult rat skeletal muscle.Am J Physiol Cell Physio1, 289: 794-801

[9]Posenjit Sen,Prabir Kumar Chakraborty and Sanghamitra Raha. (2005). Tea polyphenol epigallocatechin 3-gallate reverses the anti-apoptotic effects of lowgrade repetitive stress through inhibiton of AKT and NF-κ B survival pathways,Carcinogenesis, 24:1369-1378

[10]劉霞，李偉，徐國(guó)棟.力竭性運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血漿心鈉素及心肌血供的影響[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)2007,11(38): 7606-7608

[11]寶魯爾.心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,l 5(2):126-128

[12]吳佳妮.抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及與核因子KB活化的關(guān)系[J].西南軍醫(yī)，2007，9（3）：3 1-3 4

[13]DorseyBD, Iqbal M. (2008). Discovery of a potent, selective, and orally active proteasome inhibitor for the treatment of cancer, J Med Chem, 51(4):1068

[14]高瑞芳，常蕓等.力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌低氧誘導(dǎo)因子1表達(dá)的變化[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2 OO8，2 7（2）：149-151

(責(zé)任編輯：何聰)

Changes of Myocardial Nuclear Transcription Factor Kappa B and It's Role in Athletic Myocardial Micro-damage after One-time Exhaustive Exercise

JI Yun-xiao, CHANG Yun
(China Institute of Sport Science, Beijing 100061, China)

Objective To study the distribution and variation laws of rat heart muscle NF-κ B in gene and protein level after one-time exhaustive exercise. Method 100 healthy adult male SD rats were divided randomly into one-time exhaustive swimming group and control group. RT-PCR and immunofluorescence technology were adopted to study distribution and expression variations of rat heart muscle NF-κ B p65 at the different phases after exhaustive exercise from mRNA and protein level. Result In control group, NF-κ B mainly distributed in cell plasma, cell membrane and tunic intima, sometimes in cell nucleus. After exhaustive exercise, NF-κ B mainly distributed in cell plasma, cell membrane and tunic intima and cell nucleus. 6 hours after exhaustive exercise, NF-κ B p65 protein level of left ventricle is obviously higher than those of the control group, 12h group and 24h group (P<0.05). The NF-κ B p65 protein level of ventricular septum immediately after the exercise was significantly higher than that of the control group (P<0.05) and was much higher than the 12h group and 24h group (P<0.01). It was much higher than that of the 12h group 6 hours after the exercise. NF-κ B p65 protein level of the right ventricle was distinctly higher than those of the control group and 24h group (P<0.05) and this level of the 6h group was evidently higher than that of the control group (P<0.05). The total NF-κ B p65 protein level of heart muscle immediately after the one-time exhaustive exercise was significantly higher than that of the control group (P<0.05). This level of the 6h group was much higher than that of the control group (P<0.05). And the level of the 12h group was evidently lower than those of the immediate group and 6h group. NF-κ B p65mRNA level immediately after the one-time exhaustive exercise was clearly higher than that of the 24h group in one-time exhaustive exercise (P <0.05). The level of the 6h group was obviously higher than those of the control group and 24h group (P<0.05). The level of the 12h group was significantly higher than that of the 24h group (P<0.05). Conclusion The increase of heart muscle NF-κ BmRNA and protein expression at the different phases after the one-time exhaustive exercise may lead to a series of inflammatory reaction that can damage the cells. This is one of the occurrence mechanisms of athletic myocardial micro-damage. There is a difference in the changes of the different parts of heart after one-time exhaustive exercise. NF-κ B protein levels of ventricular septum and right ventricle rise quickly. NF-κ B protein level of the ventricular septum reaches the highest and the recovery of right ventricle NF-κ B protein changes is the lowest.

sports, power; constitution; science & technology; public service system; culture

G804.5

A

1006-1207(2012)04-0025-05

2012-06-27

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)（10-01）

冀云肖，男，研究生. 主要研究方向：運(yùn)動(dòng)心臟病理與醫(yī)學(xué)監(jiān)督.

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所，北京體育館路11號(hào)，北京100061