劉翠平，吳正鈞

光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436

乳酸菌產(chǎn)胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)指乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的黏多糖或莢膜多糖。LAB EPS是由許多重復(fù)單位構(gòu)成的帶有分支結(jié)構(gòu)的多糖，其獨(dú)特的物理流變學(xué)特性、使用安全性以及生理活性，使它在食品和非食品工業(yè)倍受青睞，尤其是它在醫(yī)藥領(lǐng)域所具有的巨大應(yīng)用潛能正日益引起人們的廣泛關(guān)注。如:可以用做增稠劑、凝膠劑和穩(wěn)定劑，能降低膽固醇，抗癌，抗?jié)?，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)免疫力或作為益生元等［1-5］。

LAB EPS的活性與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)分析對(duì)預(yù)測其生物活性功能，進(jìn)一步研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系非常重要。培養(yǎng)基組成尤其是碳源的改變對(duì)胞外多糖分子量、單糖組成和生物學(xué)活性均可能有影響［6，7］，目前的研究還存在爭議。本文利用HPLC、氣相色譜、紫外光譜和紅外光譜等測試手段對(duì)兩種碳源獲得的EPS均一多糖進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)分析，為干酪乳桿菌LC2W EPS的進(jìn)一步研究和利用以及分析構(gòu)效關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

均一多糖G1、G2(以葡萄糖為碳源經(jīng)LC2W發(fā)酵分離純化制備)［8-10］;均一多糖 L1、L2(以乳糖為碳源經(jīng)LC2W發(fā)酵分離純化制備);

表1 實(shí)驗(yàn)主要儀器Table 1 Experimental apparatus and equipments list

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 G1、G2 與L1、L2 的純度鑒定及相對(duì)分子量比較

高效液相色譜(HPLC):將不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)Dextran相繼進(jìn)樣，記錄保留時(shí)間TR，以TR為橫坐標(biāo)，LgM為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出分子量與保留時(shí)間TR的回歸方程。待測樣品按上述步驟進(jìn)樣，根據(jù)所得TR，通過回歸方程計(jì)算樣品的相對(duì)分子量。高效液相色譜條件:色譜儀Waters 2690;檢測器Waters 2410示差折光檢測器;色譜柱 Waters UltrahydrogelTM Linear(φ7.8mm ×300 mm ID)兩柱串連;流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3;柱溫45 ℃;流速0.9 mL/min;進(jìn)樣量 20 μL

1.2.2 紫外光譜(UV)分析比較

將多糖配成0.5 mg/mL溶液，在波長190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，觀察在波長280 nm和260 nm處有無吸收峰，確定多糖樣品中是否含有蛋白質(zhì)或核酸。

1.2.3 紅外光譜分析比較

將干燥多糖樣品2.0 mg與KBr研磨壓片，在4000～500 cm-1區(qū)域內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.4 單糖組成及其摩爾比比較

取待分析多糖樣品，每15～20 mg加入2 mL 1mol/L H2SO4封管105℃水解3 h，BaCO3中和，過濾去掉沉淀，真空凍干，而后進(jìn)行衍生化。

衍生物的制備(糖腈乙酸酯衍生法):稱取10 mg固體水解糖樣、10 mg鹽酸羥胺和1～2 mg內(nèi)標(biāo)，加入0.5 mL吡啶，90℃放入水中加熱反應(yīng)30 min并振蕩。取出后冷至室溫，加入0.5 mL醋酸酐，在90℃下繼續(xù)反應(yīng)30 min進(jìn)行乙酰化，反應(yīng)產(chǎn)物直接用于氣相色譜分析。

氣相色譜檢測條件如下:儀器 日本島津GC-14A;色譜柱 DB-1701 30M I.D.0.53 mm ×1.5 μm;檢測器FID(氫火焰離子化檢測器);汽化室溫度260℃;檢測器溫度260℃;程序升溫120(2)195(0.1)/10-240(10)/3;載氣壓力 (N2):0.80 kg/cm2;燃?xì)鈮毫?H2):0.65 kg/cm2;助燃?xì)鈮毫?空氣):0.50 kg/cm2;分流比 30∶1;進(jìn)樣量 0.8 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 G1、G2 與 L1、L2 的相對(duì)分子量比較

干酪乳桿菌LC2W分別以兩種碳源發(fā)酵產(chǎn)粗多糖，經(jīng)離子柱和凝膠柱分離純化后得到的中性糖G1、G2和L1、L2經(jīng)過HPLC后峰形均呈單一對(duì)稱峰，都是均一多糖。通過HPLC測得的各均一組分平均相對(duì)分子量如表2所示。

表2 不同碳源來源多糖平均相對(duì)分子量比較Table 2 Compare of average molecular weight

不同碳源獲得的多糖組分分子量存在明顯差異，以乳糖為碳源得到的中性糖兩組分相對(duì)分子量均高于以葡萄糖為碳源獲得的中性糖兩組分的相對(duì)分子量，與Sepharose CL-6B凝膠柱層析層析出峰時(shí)間差異現(xiàn)象相吻合?？赡芨淖兲荚从绊懥似鋯翁墙M成。

2.2 紫外光譜分析比較

G1、L1和G2、L2的全波長掃描結(jié)果見圖1、圖2，光譜顯示，四組分僅在190 nm處有一吸收峰，這是多糖特征性的紫外吸收峰，在260 nm和280 nm處均無明顯吸收，說明均不含有核酸、蛋白質(zhì)［11］。

2.3 紅外光譜分析比較

G1、L1 和 G2、L2 的紅外光譜見圖3、圖 4，紅外光譜顯示，不同碳源發(fā)酵分離純化得到的多糖四組分在4000 cm-1～500 cm-1范圍內(nèi)都具有糖類的特征吸收峰。3700 cm-1～3000 cm-1出現(xiàn)的寬吸收峰是O-H的伸縮振動(dòng)，表明各多糖均存在分子內(nèi)或分子間的氫鍵。2930 cm-1和1385 cm-1的吸收峰由C-H伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)引起，1400 cm-1～1200 cm-1所看到不太尖的吸收峰是C-H的變角振動(dòng)，1200 cm-1～1000 cm-1區(qū)域吸收峰為各種多糖的特征吸收峰，主要兩種C-O伸縮振動(dòng)引起，其中之一是C-O-H的，另一種是糖環(huán) C-O-C的［12］。

初步可以看出不同來源多糖組分結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)了強(qiáng)度不同的特征吸收峰，在譜峰形狀及特征吸收波段上有些差別，表明其在結(jié)構(gòu)組成上可能有差異。

2.4 單糖組成及其摩爾比比較

分析多糖樣品單糖組成常用氣相色譜法，氣相色譜法有選擇性強(qiáng)、分辨力好、靈敏度高以及分析速度快等優(yōu)點(diǎn)［12］。本試驗(yàn)采用氣相色譜法對(duì)兩種不同碳源獲得的多糖組分進(jìn)行單糖組成分析，標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)糖腈乙酸酯衍生化，在1.2.4檢測條件下測得的各標(biāo)樣氣相色譜圖見圖5。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of standard sample

樣品經(jīng)酸水解和衍生化處理后，經(jīng)氣相色譜檢測，結(jié)果如表3所示。根據(jù)保留時(shí)間確定樣品單糖組成成分，單糖含量(%)=Ai/AIi*AIS/As*WS/WIS*WIi/W*100

Ai表示某單糖樣品峰面積;

AIi表示樣品中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)峰面積;

AIS表示標(biāo)樣中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)峰面積;

As 表示某單糖標(biāo)樣峰面積;

WS表示某單糖標(biāo)樣的質(zhì)量mg;

WIS表示標(biāo)樣中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量mg;

WIi表示樣品中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量mg;

W 表示稱取多糖樣品的質(zhì)量mg。

多糖的單糖摩爾比以計(jì)算得到的單糖質(zhì)量除以其摩爾質(zhì)量再計(jì)算得到，由圖5及表3可知，G1和L1單糖組成成分相同，而且相對(duì)簡單，都是主要由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成，另外含有少量的甘露糖，但對(duì)應(yīng)單糖組分百分含量不同，G2和L2單糖組成比G1和L1復(fù)雜，主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，另外含有很少量的鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，對(duì)應(yīng)單糖組分百分含量不同。

四組分的主要單糖組成摩爾比如下:

G1——鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖 =3.07∶3.29∶1;

L1——鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖 =2.84∶6.4∶1;

G2——甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖 =17.24∶6.03∶1;

L2——甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖 =28.71∶5.98∶1。

分析表明，不同碳源獲得的多糖中性糖兩組分主要單糖組成摩爾比上有一定差異。G1和L1單糖組成相同但摩爾比不同，G2和L2也出現(xiàn)同樣現(xiàn)象，結(jié)合高效液相測定的平均相對(duì)分子量分析，改變碳源改變了干酪乳桿菌LC2W合成胞外多糖的單糖組成摩爾比，可能也是造成其分子量差異的原因。

表3 G1、L1、G2、L2的單糖組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)Table 3 Sugar composition and mass fractions of G1，L1，G2，L2(w/w%)

3 結(jié)論

將碳源以乳糖替換，其余條件都不變，分離純化中性多糖相應(yīng)組分，并從分離純化結(jié)果，分子量，單糖組成及摩爾比，紫外和紅外光譜分析幾方面進(jìn)行了分析比較，結(jié)果表明，改變碳源，EPS的分子結(jié)構(gòu)、分子量和單糖組成都發(fā)生了變化。改變碳源對(duì)干酪乳桿菌LC2W胞外多糖功能活性影響及具體構(gòu)效關(guān)系還需進(jìn)一步探討。

1 Guo BH(郭本恒).Probiotics(益生菌).Beijing:Chemical Industry Press，2004.

2 Mou GQ(牟光慶)，Li X(李霞)，Li YX(李瑤喜)，et al.Enhancement Effect of Extracellular Polysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria on Immunologic Function of Mice.Food Sci(食品科學(xué))，2009，30:260-262.

3 Dong W(董偉)，Tang YJ(唐彥君)，Liu N(劉寧)，et al.Effects of exopolysaccharide from Lactobacillus plantarum on secretion of dendritic cells in the mouse marrow.Chin Dairy Ind(中國乳品工業(yè))，2011，39(6):14-16.

4 Yang JB(楊潔彬)，Guo XH(郭興華)，et al.Lactobacillus-Biological Basis and Application(乳酸菌-生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用).Beijing:China Light Industry Press，1996.l-3.

5 Sutherland IW.Bacterial exopolysaccharides.Adv Microbiol Physiol，1972，8:143-212.

6 Van Den Berg DJC，Robijn GW，Janssen AC.Production of a novel extracellular polysaccharide by Lactobacillus sake 0-1 and characterization of the polysaccharide.Appl Environ Microbiol.1995，61:2840-2844.

7 Gassem MA，Schmidtand KA，F(xiàn)rank JF.Exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii ssp.Bulgaricus.J Food Sci，1997，62:171-173，207.

8 Liu CP(劉翠平)，Guo BH(郭本恒)，Wu ZJ(吳正鈞)，et al.Effects of nutrition factors on the exopolysaccharide production by Lactobacillus casei LC2W(營養(yǎng)因子對(duì)干酪乳桿菌LC2W胞外多糖合成的影響).Ind Microbiol(工業(yè)微生物)，2008，38(2):11-14.

9 Liu CP(劉翠平)，Wu ZJ(吳正鈞)，Wang YY(王蔭榆)，et al.Optimization of Culture Conditions for the Production of Exopolysaccharides by Lactobacillus casei LC2W Using Response-surface Methodology(響應(yīng)面法優(yōu)化干酪乳桿菌LC2W合成胞外多糖的培養(yǎng)條件).Food Ferment Ind(食品與發(fā)酵工業(yè))，2008，34(12):85-89.

10 Liu CP(劉翠平)，Ye L(葉蕾)，Wu ZJ(吳正鈞)，et al.Optimization of Preparation Procedures for Exopolysaccharides from Lactobacillus casei LC2W(干酪乳桿菌LC2W胞外多糖提取工藝研究).Acta Agric Boreali-Sinica(華北農(nóng)學(xué)報(bào))，2008，23(supplement):118-121.

11 Si L(石磊)，F(xiàn)u YL(傅佑麗)，Chen KS(陳靠山)，Separation，Purification and Component Research of a Polysaccharide from the Roots of Cudrania tricuspidata(Carr.)Bur..J Shandong Univ，Nat Sci(山東大學(xué)學(xué)報(bào)，理學(xué)版)，2007，42(5):74-78.

12 Zhang WJ(張惟杰).Biochemistry Research Technique of Glycoconjugates(2ndEdition)(糖復(fù)合物生化研究技術(shù)，第二版)，Hangzhou:Zhejiang University Press，2003.