李杜漸 徐耀庭 韋 芳 李惠民 黃汝強 許曉文 顧 煒 顧偉平

1 上海市第一人民醫(yī)院分院泌尿外科 200081； 2 上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院實驗中心

卡介苗（Bacillus Calmette－Guerin，BCG）膀胱內(nèi)灌注治療表淺性膀胱移行細(xì)胞癌，是目前最成功的腫瘤免疫治療。但與此同時其顯著的毒副反應(yīng)使得卡介苗在臨床上的應(yīng)用受到限制。因此利用基因工程技術(shù)改造BCG菌株，以加強其免疫原性和抗瘤作用是，降低其毒副作用是大家研究的熱點。由于單核細(xì)胞趨化因子－1（MCP－1）在膀胱腫瘤免疫治

療中起到重要作用且與BCG治療效果有關(guān)。因此，本實驗利用基因工程技術(shù)在克隆BCG Ag85B和MCP－1基因的基礎(chǔ)上，將構(gòu)建穿梭表達(dá)質(zhì)粒，欲將該質(zhì)粒導(dǎo)入BCG，使BCG表達(dá)分泌MCP－1，達(dá)到構(gòu)建重組BCG的目的。

1 材料和方法

1.1 材料 Taq DNA 聚合酶、Eco RⅠ、SaⅡ、Bam HⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker DL2000、Marker DL15000購于上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。BCG上海丹麥株由上海市生物制品研究所惠贈。質(zhì)粒p M V261（Stover CK博士構(gòu)建）由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院徐恒教授惠贈 。人MCP－1c DNA由上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院實驗中心提供。大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞購于天根生化科技（北京）有限公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒購于上海華舜生物工程公司。

1.2 引物合成及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增 根據(jù)BCG抗原85B（BCG Ag85B）信號肽序列自行設(shè)計一 對引物。F5’端引入Bam HⅠ酶切位點，R：5’端引入Eco RⅠ酶切位點。F：5’GATGGA TCCAA T GACAGACGTGAGCCGAAAG3’；R：5’GTAGA A TTCCGCGCCCGCGGT TGCCGCTCC 3’。MCP－1的引物 設(shè)計，F(xiàn)：5’CGGA A TTCCACTCTCGCCTCCAGCA TGA AA3’，R：5’ACGCGTCGACGG GTTGTGGAGTGAGTGTTCAA3’。F：5’端引入Eco RⅠ酶切位點，R：5’端引入SaⅡ酶切位點。引物由上海皓嘉科技發(fā)展有限公司合成。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性45s，60℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，共循環(huán)30次，最后72℃繼續(xù)延伸7min。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒參照產(chǎn)品說明書進行純化。

1.3 質(zhì)粒p M V261的提取和純化 用堿裂解法提取質(zhì)粒進行［1］。

1.4 重組質(zhì)粒p MS的構(gòu)建 將合成后的BCG Ag85B信號肽基因克隆至質(zhì)粒p MV261并測序鑒定。信號肽基因及質(zhì)粒p MV261分別用Bam HⅠ和EcoRⅠ酶雙酶切，p MV261酶切后加入小牛腸堿性磷酸酶1U，于37℃去磷酸化1h，經(jīng)酚∶氯仿（1∶1）抽提，無水乙醇沉淀、70%乙醇洗滌后溶于TE中。然后加入10×連接緩沖液2μL、T4DNA連接酶1μL，以純水補足總體積為2μL，于16℃進行連接反應(yīng)16h，構(gòu)建重組質(zhì)粒p MS。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化按說明書進行。

1.5 陽性重組質(zhì)粒p MS的篩選與鑒定 重組質(zhì)粒p MS的篩選與鑒定參見文獻(xiàn)［2］。

1.6 MCP－1基因與上述陽性重組質(zhì)粒的連接和轉(zhuǎn)化 純化后的MCP－1基因c DNA和上述陽性重組質(zhì)粒p MS用Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切后，按照4方法連接與轉(zhuǎn)化。

1.7 陽性重組質(zhì)粒p MS MCP－1的篩選與鑒定按照4方法篩選由上海生工生物工程有限公司進行測序與鑒定。采用克隆位點上游的啟動子序列作為測序引物進行測序。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒p MS的鑒定 （1）酶切鑒定：選取經(jīng)電泳初步檢測比p M V261較大的質(zhì)粒，將其用Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切，以酶切產(chǎn)物為模板，用信號肽兩端引物進行PCR擴增，出現(xiàn)120bp左右的目的基因條帶（見圖1）。初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，該重組質(zhì)粒命名為p MS。（2）測序鑒定：用信號肽測序引物測序 ，由測序結(jié)果可知信號肽已經(jīng)克隆到p M V261載體中 ，進一步證實了重組質(zhì)粒p MS構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定圖

2.2 重組質(zhì)粒p MS MCP－1的鑒定 （1）酶切鑒定：選取經(jīng)電泳初步檢測比p MS較大的質(zhì)粒，將其用Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，質(zhì)粒已完全打開，出現(xiàn)4 188bp和300bp兩條帶，顯示300bp的帶為插入MCP－1片斷，4 188 kb帶為質(zhì)粒p MS（見圖1）。初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為p MS MCP－1。（2）測序鑒定：將p MS MCP－1陽性重組質(zhì)粒進行序列分析。由上海生工生物工程有限公司進行測序，采用克隆位點上游的啟動子序列作為測序引物進行測序，兩種擴增產(chǎn)物的結(jié)果與理論值完全一致。由上述質(zhì)粒構(gòu)建過程可知，在p M V261的Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位點以及p MS的Eco RⅠ和SalⅠ酶切位點之間，分別插入了一約120bp和300bp的片段，而得到一新重組質(zhì)粒，120bp片段為BCG Ag85B信號肽，而300bp的片段為MCP－1基因 ，進一步證實了重組質(zhì)粒p MS MCP－1構(gòu)建成功。

3 討論

人們對BCG治療膀胱腫瘤的局部抗瘤免疫反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞趨化蛋白－1（monocyte chemotactic protein－1，MCP－1）在BCG抗膀胱腫瘤過程中膀胱局部表達(dá)明顯增強。膀胱內(nèi)無瘤狀態(tài)的維 持 與 MCP－1 的 水 平 表 達(dá) 關(guān) 系 密 切［3～5］。 對MCP－1前期的研究中發(fā)現(xiàn)MCP－1具有良好的抗膀胱 腫 瘤 作 用［6～8］。 筆 者 在 克 隆 BCG Ag85B 和MCP－1基因的基礎(chǔ)上 ，構(gòu)建了穿梭表達(dá)質(zhì)粒。下一步將通過電穿孔法把該質(zhì)粒導(dǎo)入BCG中，使BCG分泌表達(dá)MCP－1，從而達(dá)到構(gòu)建重組BCG的目的。該重組BCG可望在免疫原性及抗瘤效應(yīng)方面優(yōu)于BCG。其理由有以下幾點：（1）選用的穿梭表達(dá)質(zhì)粒屬于染色體外質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BCG后不會改變其染色體的結(jié)構(gòu)與功能，因此不會改變BCG的減毒特性。（2）穿梭表達(dá)質(zhì)粒可將 MCP－1基因轉(zhuǎn)入BCG中，使重組BCG同時具有BCG和MCP－1的雙重功能。（3）進行膀胱灌注時，重組BCG可直接接觸和刺激腫瘤組織，局部表達(dá)的較高濃度的MCP－1既可直接殺死腫瘤細(xì)胞，也能夠增強重組BCG介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。同時重組BCG和 MCP－1只黏附在腫瘤周圍，不進入血液循環(huán)系統(tǒng)，故毒副作用減少。綜上所述，通過構(gòu)建了穿梭表達(dá)質(zhì)粒p MS MCP－1，為下一步構(gòu)建表達(dá)分泌性 MCP－1的重組BCG打下了堅實的基礎(chǔ)。

［1］ Sambrook KJ，F(xiàn)ritisch EF，Maniatis T.Molecular cloning laboratory mannual〔M〕.2nd.New York：Cold Spring Harbour Labortory Press，1989：16，322.

［2］ 夏術(shù)階，劉海濤，孫曉文，等.卡介苗穿梭表達(dá)質(zhì)粒p MS腫瘤壞死因子的構(gòu)建與鑒定〔J〕.中華實驗外科雜志，2005，22（3）：495－497.

［3］ Luo Y，Chen X，O’Donnell MA.Mycobacterium bovis bacillus Calmette－Guérin（BCG）induces human CC－and CXC－chemokines in vitro and in vivo〔J〕.Clin Exp Immunol，2007，147（2）：370－378.

［4］ Reale M，Intorno R，Tenaglia R，et al.Production of MCP－1 and RANTES in bladder cancer patients after bacillus Calmette－Guerin immunotherapy〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2002，51（2）：91－98.

［5］ Méndez－Samperio P，Vázquez A，Ayala H.Infection of human monocytes with Mycobacterium bovis BCG induces production of CC－chemokines〔J〕.J Infect，2003，47（2）：139－147.

［6］ 李杜漸，楊宇如，魏強，等.單核細(xì)胞趨化蛋白－1對膀胱腫瘤荷瘤裸鼠的作用〔J〕.華西醫(yī)學(xué)，2003，18（4）：536－537.

［7］ 李杜漸，陳一戎，王志平，等.單核細(xì)胞趨化蛋白－1對膀胱腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞增殖的作用〔J〕.現(xiàn)代泌尿外科，2004，9（3）：137－139.

［8］ 李杜漸，楊宇如，李響，等.單核細(xì)胞趨化因子及鐘聲蛋白樣受體在卡介苗灌注膀胱局部抗腫瘤免疫反應(yīng)中的表達(dá)〔J〕.臨床泌尿外科雜志，2006，21（11）：859－862.