孫國祥， 趙梓余

(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽110016)

速效救心丸是由川芎、冰片等制成的滴丸劑，用量小、起效快、服用方便，是治療冠心病和心絞痛常用藥物［1-2］。川芎辛、溫，具有止痛、活血、行氣作用。冰片辛、苦，微寒，具有開竅醒神、清熱、止痛作用。兩者合用，可充分發(fā)揮兩藥辛香走竄之力，以達(dá)活血化瘀、開竅醒神之功［2］。中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)中用TLC鑒定川芎成分并用GC法測定冰片中成分含有量［1］。文獻(xiàn)中測定其中金屬元素［3］和氟［4］，利用紅外光譜進(jìn)行聚類分析研究［5］。曾用單波長HPLC數(shù)字化指紋譜評價其質(zhì)量，本實驗建立五波長HPLC指紋圖譜對其質(zhì)量進(jìn)行控制。中藥色譜指紋圖譜必然走向?qū)χ兴庍M(jìn)行整體定量控制，系統(tǒng)指紋定量法是鑒定中藥整體化學(xué)物質(zhì)的簡便可靠方法［6］。通過建立五波長HPLC指紋圖譜對速效救心丸進(jìn)行全面質(zhì)量評價，充分挖掘全指紋在最佳波長下信息，以增強(qiáng)方法靈敏度和準(zhǔn)確度。

1 儀器、試劑與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，ChemStation工作站(Agilent科技有限公司)，Sarturius-BS110S分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，甲醇(色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠)，乙腈(色譜純，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水為去離子水。

阿魏酸對照品(Ferulic acid，F(xiàn)A，批號 0773-9910)，購自中國藥品生物制品檢定所。藁本內(nèi)酯對照品(Ligustulide，LGS，純度不低于 99.2%，自制)。12批速效救心丸(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司第六制藥廠)，批號:S1(616062)、S2(619256)、S3(610064)、S4(619166)、S5(619187)、S6(619254)、S7(610020)、S8(610097)、S9(619240)、S10(610013)、S11(610098)和 S12(610031)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 大連江申CenturySIL C18BDS柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相 A 為水 -0.1%磷酸，B為乙腈-0.1%磷酸;梯度洗脫(0～15 min，5% ～15%B;15～30 min，15% ～30%B;30～50 min，30% ～50%B;50～60 min，50% ～65%B;60～70 min，65% ～85%B;70 ～90 min，85%B);體積流量1.0 mL/min;檢測波長 265 nm，276 nm，290 nm，300 nm和310 nm;柱溫(30±0.15)℃;進(jìn)樣量20 μL;洗脫時間90 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 用甲醇配制40 μg/mL阿魏酸對照品溶液，同法配制50 μg/mL藁本內(nèi)酯對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取速效救心丸10粒，精密稱定，加體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液定容至10 mL，超聲5 min，搖勻，作供試液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 將S1樣品溶液，阿魏酸和藁本內(nèi)酯對照品溶液分別進(jìn)樣20 μL，記錄譜圖，見圖1。確定6號峰為阿魏酸，21號峰為藁本內(nèi)酯，選藁本內(nèi)酯峰作參照物峰，其理論板數(shù)應(yīng)不低于38萬。2 h空針圖證明無干擾峰，依據(jù)2 h供試液圖確定洗脫90 min。

圖1 速效救心丸HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Suxiao Jiuxin Pill

2.4 精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗 按上述色譜條件，取S1供試液連續(xù)進(jìn)樣6次測定精密度;配制S1供試液6份進(jìn)樣測定重復(fù)性;分別在S1樣品供試液制備后0、5、10、15、20、24 h 進(jìn)樣測定穩(wěn)定性。以藁本內(nèi)酯峰的保留時間和峰面積為參照，計算五波長下各指紋峰的相對保留時間RSD＜2.0%和相對峰面積的RSD＜5.0%。結(jié)果表明精密度和重復(fù)性良好，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 系統(tǒng)指紋定量法和鑒定標(biāo)準(zhǔn)［7-8］系統(tǒng)指紋定量法是用宏定性相似度Sm整體監(jiān)測化學(xué)指紋數(shù)量和分布比例，用宏定量相似度Pm整體監(jiān)測化學(xué)指紋整體出峰數(shù)和峰高，用指紋均化性變異系數(shù)α絕對值限定指紋變異性。用三者大小可定量鑒定中藥質(zhì)量，見表1。

表1 中藥質(zhì)量級別鑒定標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The criteria of TCM quality grades

2.6 速效救心丸五波長HPLC指紋圖譜建立 將12批供試液進(jìn)樣分析并記錄色譜圖，見圖2。以藁本內(nèi)酯為參照物，按峰出現(xiàn)率70%(S/N≥5)計，確定指紋峰為 29(265 nm)、31(276 nm)、29(290 nm)、27(300 nm)和24(310 nm)。將290 nm 圖譜積分AIA文件導(dǎo)入軟件按均值法生成準(zhǔn)對照指紋譜(PRFP)并評價12批樣品，以Sm和Pm為指標(biāo)進(jìn)行聚類分析得 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S9、S10和S12為第Ⅰ類，S8和S11為第Ⅱ類。依據(jù)Sm和Pm接近，故選第I類10批樣品按均值法生成五波長下對照指紋譜 (RFPs)，再次評價各波長下速效救心丸質(zhì)量見表2。

圖2 在5個波長下12批速效救心丸HPLC指紋譜和其對照指紋譜Fig.2 HPLC fingerprints of 12 batches of Suxiao Jiuxin Pilland theRFPsunder five wavelength

2.7 用FW-HPLC-FP評價速效救心丸［9］在265、276、290、300、310 nm 波長檢測 12 批樣品Sm，Pm和α見表2，分別以五個波長的對照指紋圖譜作參照。橫向比較12批樣品在任一波長檢測到的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量、分布比例和指紋比例變異情況都較相似，但各成分含有量有顯著差異導(dǎo)致質(zhì)量級變化?？v向比較同一樣品在不同波長質(zhì)量有顯著差異，說明任何單波長指紋譜鑒定質(zhì)量結(jié)果具有片面性，必須對不同波長結(jié)果進(jìn)行合理整合。

2.8 均值法(AM)和主成分整合法(PCI)評價速效救心丸 將五波長下的Sm，Pm和α取均值重新評價12批速效救心丸見表2。主成分分析是應(yīng)用廣泛的多元統(tǒng)計方法，用于簡化數(shù)據(jù)，快速實現(xiàn)模式或關(guān)系的可視化識別［10］。利用SPSS 16.0分別以Sm、Pm和α值與不同的波長組成矩陣進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn)，分別得到1、1、3個主成分，主成分的累計貢獻(xiàn)率大于90%。計算時將原始數(shù)據(jù)利用因子系數(shù)得分矩陣重新整合［11］得到新的Sm、Pm和α，再次評價速效救心丸質(zhì)量級，其結(jié)果與均值法鑒定結(jié)果完全一致，相互驗證。AM和PCI鑒定出S12(2級)質(zhì)量很好;S3、S4、S6和S7(3級)質(zhì)量好;S10(5級)質(zhì)量中等;S1和S9(7級)質(zhì)量次;S2、S5、S8 和 S11(8級)質(zhì)量劣。

3 討論

速效救心丸中主要化學(xué)成分有生物堿類川芎嗪、有機(jī)酸類阿魏酸和內(nèi)酯類藁本內(nèi)酯等，在260～320 nm附近有較強(qiáng)紫外吸收，任何單波長指紋譜無法對速效救心丸進(jìn)行準(zhǔn)確表征。多波長指紋譜能實現(xiàn)指紋譜信息最大化，從DAD所記錄190～400 nm色譜圖中選取重點波長 265、276、290、300、310 nm建立速效救心丸五波長譜可最大限度獲取該制劑中復(fù)雜化學(xué)指紋定性定量全信息。12批藥物中一批整體指紋含有量過低，三批含有量過高。本實驗結(jié)果表明中國藥典僅規(guī)定幾個指標(biāo)成分含有量下限做法顯然不科學(xué)，其嚴(yán)重忽視因化學(xué)指紋含有量過高而導(dǎo)致的用藥不安全問題。

表2 基于FW-HPLC-FPs定量指紋譜評價12批速效救心丸質(zhì)量Tab.2 The 12 batches of Suxiao Jiuxin Pill quality evaluated based on FW-HPLC-FPs

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